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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » 核酸提取 » RT-PCR
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紫眸玉儿

木虫 (小有名气)

[求助] RT-PCR 已有7人参与

最近在做RT-PCR，提取完RNA后，电泳时明显三条带，去除DNA后，反转录成CDNA，测其浓度，均达到2ug,而且在260处有最大吸收峰，自我感觉挺好的，就用内参和目的基因的引物跑了PCR，电泳后发现连内参都没有跑出条带，问题处在哪呢？哪位大虾帮解答一下，谢谢！
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1楼 2014-05-09 20:01:52
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gyesang

荣誉版主 (著名写手)

优秀版主优秀版主

【答案】应助回帖

★ ★ ★ ★
感谢参与，应助指数 +1
kx444555: 金币+4, 鼓励交流 2014-05-11 08:58:26
1. 提取完RNA后，电泳时明显三条带，说明RNA提取成功
2. 内参也没有跑出条带，说明不是你特异基因引物设计问题

基于以上两点，问题可能出在你的逆转录步骤，逆转录失败了
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学术问题讨论咨询发邮件gyesang@163.com
2楼2014-05-09 22:50:22
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Neo2000

木虫 (著名写手)

【答案】应助回帖

感谢参与，应助指数 +1
你怎么测的cDNA浓度？内参引物有没有问题，反转录有没有问题？

[ 发自小木虫客户端 ]
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3楼2014-05-10 07:25:53
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紫眸玉儿

木虫 (小有名气)
引用回帖:
2楼: Originally posted by gyesang at 2014-05-09 22:50:22
1. 提取完RNA后，电泳时明显三条带，说明RNA提取成功
2. 内参也没有跑出条带，说明不是你特异基因引物设计问题

基于以上两点，问题可能出在你的逆转录步骤，逆转录失败了

增加到33个PCR循环数后，内参跑出了，但条带不是很亮，目的基因仍然没有扩增出来。我这是做的半定量PCR，是不是目的基因扩增大小要跟内参片段大小差不多呢？
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4楼2014-05-10 10:28:41
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Jacob_24

木虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

★ ★
感谢参与，应助指数 +1
kx444555: 金币+2, 鼓励交流 2014-05-11 08:58:32
PCR有问题  没有P出来（引物?退火温度？）
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CCC
5楼2014-05-10 10:30:07
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BioChen

银虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

★ ★ ★
感谢参与，应助指数 +1
kx444555: 金币+3, 鼓励交流 2014-05-11 08:58:36
http://pga.mgh.harvard.edu/primerbank/
做RT的话，引物最好用文献中报道过的或者primerbank找。
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6楼2014-05-10 20:31:11
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18252091017

新虫 (初入文坛)
引用回帖:
6楼: Originally posted by BioChen at 2014-05-10 20:31:11
http://pga.mgh.harvard.edu/primerbank/
做RT的话，引物最好用文献中报道过的或者primerbank找。

我最近也是在做rt-pcr,内参可以p出来，但目的条带p不出来……用别人的细胞提取的RNA,逆转录，可以p出来，但用我的却P不出来。我的引物是从文献中查出来的。求指点！
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7楼2014-05-12 14:01:12
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18252091017

新虫 (初入文坛)

【答案】应助回帖

感谢参与，应助指数 +1
我最近也是在做rt-pcr,内参可以p出来，但目的条带p不出来……用别人的细胞提取的RNA,逆转录，可以p出来，但用我的却P不出来。我的引物是从文献中查出来的。
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8楼2014-05-12 14:01:22
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fanwq258

木虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

★ ★
感谢参与，应助指数 +1
gyesang: 金币+2, 鼓励回帖交流！ 2014-05-12 15:20:10
cDNA浓度如何测定的？你纯化了？如果未纯化，侧出来的不是cDNA浓度，里边dNTP等一系列的东西都会影响的。
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要么好好活，要么死，拒绝半死不活
9楼2014-05-12 14:52:28
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OmicsLink

银虫 (初入文坛)

【答案】应助回帖

一、反转录；二、引物。
影响反转录效果的原因就多了去了，一些很细微的操作失误都会影响结果，导致条带消失。引物方面，试下验证引物吧，很多公司都有，推荐GeneCopoiea，口碑不错。
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一切有为法，如露如闪电
10楼2014-05-13 17:21:45
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