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紫眸玉儿

木虫 (小有名气)

[求助] RT-PCR 已有7人参与

最近在做RT-PCR,提取完RNA后,电泳时明显三条带,去除DNA后,反转录成CDNA,测其浓度,均达到2ug,而且在260处有最大吸收峰,自我感觉挺好的,就用内参和目的基因的引物跑了PCR,电泳后发现连内参都没有跑出条带,问题处在哪呢?哪位大虾帮解答一下,谢谢!
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gyesang

荣誉版主 (著名写手)

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【答案】应助回帖

★ ★ ★ ★
感谢参与,应助指数 +1
kx444555: 金币+4, 鼓励交流 2014-05-11 08:58:26
1. 提取完RNA后,电泳时明显三条带,说明RNA提取成功
2. 内参也没有跑出条带,说明不是你特异基因引物设计问题

基于以上两点,问题可能出在你的逆转录步骤,逆转录失败了
学术问题讨论咨询发邮件gyesang@163.com
2楼2014-05-09 22:50:22
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Neo2000

木虫 (著名写手)

【答案】应助回帖

感谢参与,应助指数 +1
你怎么测的cDNA浓度?内参引物有没有问题,反转录有没有问题?

[ 发自小木虫客户端 ]
3楼2014-05-10 07:25:53
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紫眸玉儿

木虫 (小有名气)

引用回帖:
2楼: Originally posted by gyesang at 2014-05-09 22:50:22
1. 提取完RNA后,电泳时明显三条带,说明RNA提取成功
2. 内参也没有跑出条带,说明不是你特异基因引物设计问题

基于以上两点,问题可能出在你的逆转录步骤,逆转录失败了

增加到33个PCR循环数后,内参跑出了,但条带不是很亮,目的基因仍然没有扩增出来。我这是做的半定量PCR,是不是目的基因扩增大小要跟内参片段大小差不多呢?
4楼2014-05-10 10:28:41
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Jacob_24

木虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

★ ★
感谢参与,应助指数 +1
kx444555: 金币+2, 鼓励交流 2014-05-11 08:58:32
PCR有问题  没有P出来(引物?退火温度?)
CCC
5楼2014-05-10 10:30:07
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BioChen

银虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

★ ★ ★
感谢参与,应助指数 +1
kx444555: 金币+3, 鼓励交流 2014-05-11 08:58:36
http://pga.mgh.harvard.edu/primerbank/
做RT的话,引物最好用文献中报道过的或者primerbank找。
6楼2014-05-10 20:31:11
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18252091017

新虫 (初入文坛)

引用回帖:
6楼: Originally posted by BioChen at 2014-05-10 20:31:11
http://pga.mgh.harvard.edu/primerbank/
做RT的话,引物最好用文献中报道过的或者primerbank找。

我最近也是在做rt-pcr,内参可以p出来,但目的条带p不出来……用别人的细胞提取的RNA,逆转录,可以p出来,但用我的却P不出来。我的引物是从文献中查出来的。求指点!
7楼2014-05-12 14:01:12
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18252091017

新虫 (初入文坛)

【答案】应助回帖

感谢参与,应助指数 +1
我最近也是在做rt-pcr,内参可以p出来,但目的条带p不出来……用别人的细胞提取的RNA,逆转录,可以p出来,但用我的却P不出来。我的引物是从文献中查出来的。
8楼2014-05-12 14:01:22
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fanwq258

木虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

★ ★
感谢参与,应助指数 +1
gyesang: 金币+2, 鼓励回帖交流! 2014-05-12 15:20:10
cDNA浓度如何测定的?你纯化了?如果未纯化,侧出来的不是cDNA浓度,里边dNTP等一系列的东西都会影响的。
要么好好活,要么死,拒绝半死不活
9楼2014-05-12 14:52:28
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OmicsLink

银虫 (初入文坛)

【答案】应助回帖

一、反转录;二、引物。
影响反转录效果的原因就多了去了,一些很细微的操作失误都会影响结果,导致条带消失。引物方面,试下验证引物吧,很多公司都有,推荐GeneCopoiea,口碑不错。
一切有为法,如露如闪电
10楼2014-05-13 17:21:45
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