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请教下1kb的目的片段怎么总连接不上9kb的载体？
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| 这个连接是单酶切后的粘性末端连接，9kb载体在连接之前也用了NEB的热敏磷酸酶做了去磷酸化，然后再连接、转化再筛选，设计了3对检测引物，全套程序已经做了五六次了，就是筛不到阳性克隆，连接反应尝试了3比1到20比1的摩尔浓度比，除了一次用室温连接10分钟，其余5次都是16℃连接过夜的，转化中的热击也是60秒到90秒都试过了，转化效率挺高，1毫升的菌液只敢取50微升涂平板，不然长出来的菌落就会非常密集，然后每次挑克隆都挑24-48个，用菌液PCR检测，就是检不到阳性克隆啊，求解释求助啊！ |
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