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关于用Ellman法测巯基，在计算中出现负值是怎么回事 已有1人参与
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参考的方法如下： 取1mL在2.3.3.6中配制的豆浆溶液加入2.0mL的缓冲液1（每升溶液含10.4gTris，6.9g甘氨酸，1.2g EDTA，pH=8.0）或缓冲液2（每升溶液含10.4gTris，6.9g甘氨酸，1.2g EDTA，480g尿素，pH=8.0）后再加入0.02mL的Ellman试剂（0.2gDTNB溶于50ml缓冲溶液1中），25℃下保温5min，采用可见分光光度计，在412nm处测定吸光值。实验以不加豆浆，而加Ellman试剂为空白。巯基含量的测定= 73.53*A412*D/C , 式中A412为有DTNB存在时豆浆的吸光值减去无DTNB存在时豆浆的吸光值，D为稀释倍数，C为豆浆固形物含量 这是一篇文献中测定巯基的方法，我也是按这个过程操作的，在计算过程中A412（有DTNB存在时豆浆的吸光值减去无DTNB存在时豆浆的吸光值）出现了负值，不知道有么有人知道可能是什么问题造成的呢，该怎样处理这个问题，而且已经重复做了试验，确定不是操作失误，会出现三四个负值，请问方法有什么可能存在的问题吗？求大神解答啊 |
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测定总巯基含量时，15 mg蛋白样品溶解于5 mL含8 M 尿素的Tris-Gly 缓冲液（0.086 M Tris, 0.09 M Gly 和 0.04 M EDTA, pH 8.0）。测定自由巯基含量时，15 mg样品溶解于5 mL不含尿素的上述Tris-Gly 缓冲液中，而后加入50 μL Ellman 试剂 （DTNB, 即5,5-二硫基双2-硝基苯甲酸溶于Tris-Gly 缓冲液，4 mg/mL），在25℃条件下保温反应60 min, 离心（5000 g, 15 min），上清液在412 nm 处测定吸光值，以含Ellman 试剂的Tris-Gly 缓冲液为空白对照。 巯基含量的计算公式如下： SH (μmol/g) = 73.53×A ×D/C 式中：A —除去试剂空白后样品的吸光度值 D—稀释倍数 C—样品浓度（mg/mL） 问题1：上述公式中稀释倍数D是怎么算的（具体的式子），如果完全按照上述方法是不是就是1？ 问题2：我测的物质为毛发固体样品，二硫键含量在350μmol/g附近，此种测试方法是否具有可行性 问题3：由于毛发样品中含有非水溶性蛋白，又没哟测量二硫键含量的更好的方法 |
7楼2015-10-07 21:26:24
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