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北京石油化工学院2026年研究生招生接收调剂公告
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model031

银虫 (正式写手)

[交流] 从质粒扩片段为什么扩不出来?

我设计了一对引物,在两端加了两个酶切位点,与摸板配对的序列有18个,加上酶切位点和保护碱基一共27个.配对那部分序列的Tm值很低正 反向分别有43 和39左右,请问我退火温度设到多少合适啊!
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bijiaoyingyang

金虫 (小有名气)

不要着急。

不要着急,做分子生物学就是这样子。
温度从38到44度,非特异性的条带很亮,很多这样的问题主要是引物特异性差。况且退火温度不高。你最好重新设计引物,确保退火温度,这点要首先保证。至于特异性,由于加上酶切位点的位点就受到了极大的限制,但是还是可以稍微变动的。比如引物可以在26---32个碱基之间,加适当个数的保护碱基等。
11楼2008-03-11 11:03:17
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lauren180

木虫 (著名写手)

小木虫挖井人

退火温度低点了,40℃试试吧
细推物理须行乐。
2楼2008-03-04 20:20:59
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model031

银虫 (正式写手)

这样会不会有很多非特意性的条带啊,我准备设个浓度剃度从42到53不知道行不行 我们实验室有个PCR仪可以设剃度
3楼2008-03-04 20:38:38
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totoro一家亲

铜虫 (小有名气)

举例说明,上游引物Tm是45度、下游50度。那么退火应该是45-5=40度。
但是40度确实很低,你可以考虑设置touch down PCR
不要太过于在意非特异性的带,你要首先P得出来再优化
如果实在不行,把你要得带做个胶回收也行呀
4楼2008-03-05 16:52:16
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