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LiCl毕赤酵母感受态制备需要向大肠杆菌那样冰浴吗已有1人参与
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| LiCl毕赤酵母感受态制备需要向大肠杆菌那样冰浴吗？第一次没冰长出来很少，不知道是不是这个问题。 |
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liyu0355
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制备KM71感受态细胞 a. 从活化的YPD平板上挑取一个单菌落接种于5mLYPD液体培养基，28℃摇床250 rpm过夜培养。 b. 接种1mL过夜培养液于100mL新鲜YPD液体培养基，28℃摇床250 rpm扩大培养至OD600 =1.3-1.5。 c. 4, ℃4000rpm离心5min收集菌体细胞，用100mL冰冷无菌水重悬菌体细胞。 d. 重复上步操作一遍。 e. 4, ℃4000×g离心5min收集菌体细胞，用50mL冰冷1mol⋅L-1山梨醇溶液重悬菌体细胞。 f. 4, ℃4000rpm离心5min收集菌体细胞，用1mL冰冷11mol⋅L-1山梨醇溶液重悬菌体细胞。置于冰上备用(也可将此感受态细胞分装200μL于离心管中冻存备用，但其转化效率将明显下降)。 |
5楼2014-05-05 09:24:04
xiaoamuchong
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laozuzunzhe: 金币+4, good！ 2014-04-17 09:17:48
新乡小树: 金币+5, 这个步骤我在网上查到了，只是想知道冰浴感受态不？ 2014-04-17 13:50:25
新乡小树: 金币+10, ★有帮助 2014-04-17 19:01:50
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新乡小树: 金币+10, ★有帮助 2014-04-17 19:01:50
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将毕赤酵母GS115于50 mlYPD液体培养基，30℃，250 rpm培养至OD600值为0.8-1.0； 于室温1500g离心5 min收集酵母细胞，弃上清； 用25ml灭菌三蒸水洗酵母细胞，随后于室温1500g离心5 min离心收集细胞，弃上清； 用1 ml 100mMLicl重悬酵母细胞至1.5ml离心管中，以最大转速离心15秒，弃去上清， 用400ul100mMLicl重悬酵母细胞，分装。 转化： 将感受态细胞离心，弃去上清，然后依次加入 240ul50％PEG4000 36ul1MLicl 25ul2mg/ml 单链DNA 50ul用水溶解的质粒DNA（5-10ug） 剧烈震荡，混匀； 30℃温育30分钟，平稳放置； 42℃热激20-25分钟； 6000-8000rpm离心，弃去上清； 用1ml灭菌水轻轻重悬； 取部分涂于相应的平皿，2-4天可见单个的克隆。 |
2楼2014-04-16 22:00:19
新乡小树
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3楼2014-04-17 13:49:29
xiaoamuchong
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4楼2014-04-17 17:10:18