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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 微生物 » 发酵/表达 » LiCl毕赤酵母感受态制备需要向大肠杆菌那样冰浴吗
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新乡小树

捐助贵宾 (正式写手)

[求助] LiCl毕赤酵母感受态制备需要向大肠杆菌那样冰浴吗 已有1人参与

LiCl毕赤酵母感受态制备需要向大肠杆菌那样冰浴吗？第一次没冰长出来很少，不知道是不是这个问题。
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1楼 2014-04-16 12:41:19
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xiaoamuchong

专家顾问 (职业作家)

科研工作者

【答案】应助回帖

★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★
感谢参与，应助指数 +1
laozuzunzhe: 金币+4, good！ 2014-04-17 09:17:48
新乡小树: 金币+5, 这个步骤我在网上查到了，只是想知道冰浴感受态不？ 2014-04-17 13:50:25
新乡小树: 金币+10, ★有帮助 2014-04-17 19:01:50
将毕赤酵母GS115于50 mlYPD液体培养基，30℃，250 rpm培养至OD600值为0.8-1.0；
于室温1500g离心5 min收集酵母细胞，弃上清；
用25ml灭菌三蒸水洗酵母细胞，随后于室温1500g离心5 min离心收集细胞，弃上清；
用1 ml 100mMLicl重悬酵母细胞至1.5ml离心管中，以最大转速离心15秒，弃去上清，
用400ul100mMLicl重悬酵母细胞，分装。
转化：
将感受态细胞离心，弃去上清，然后依次加入
240ul50％PEG4000
36ul1MLicl
25ul2mg/ml 单链DNA
50ul用水溶解的质粒DNA（5-10ug）
剧烈震荡，混匀；
30℃温育30分钟，平稳放置；
42℃热激20-25分钟；
6000-8000rpm离心，弃去上清；
用1ml灭菌水轻轻重悬；
取部分涂于相应的平皿，2-4天可见单个的克隆。
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曾经有人问我为什么要学微生物，我只是想离生命的本质更近一点。
2楼2014-04-16 22:00:19
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新乡小树

捐助贵宾 (正式写手)
引用回帖:
2楼: Originally posted by xiaoamuchong at 2014-04-16 22:00:19
将毕赤酵母GS115于50 mlYPD液体培养基，30℃，250 rpm培养至OD600值为0.8-1.0；
于室温1500g离心5 min收集酵母细胞，弃上清；
用25ml灭菌三蒸水洗酵母细胞，随后于室温1500g离心5 min离心收集细胞，弃上清；
用1 ...

麻烦问下，用400ul100mMLicl重悬酵母细胞后需要在冰里冰浴吗？
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3楼2014-04-17 13:49:29
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xiaoamuchong

专家顾问 (职业作家)

科研工作者
引用回帖:
3楼: Originally posted by 新乡小树 at 2014-04-17 13:49:29
麻烦问下，用400ul100mMLicl重悬酵母细胞后需要在冰里冰浴吗？...

不用的呐。
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曾经有人问我为什么要学微生物，我只是想离生命的本质更近一点。
4楼2014-04-17 17:10:18
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liyu0355

木虫 (正式写手)
制备KM71感受态细胞
a. 从活化的YPD平板上挑取一个单菌落接种于5mLYPD液体培养基，28℃摇床250 rpm过夜培养。
b. 接种1mL过夜培养液于100mL新鲜YPD液体培养基，28℃摇床250 rpm扩大培养至OD600 =1.3-1.5。
c. 4, ℃4000rpm离心5min收集菌体细胞，用100mL冰冷无菌水重悬菌体细胞。
d. 重复上步操作一遍。
e. 4, ℃4000×g离心5min收集菌体细胞，用50mL冰冷1mol⋅L-1山梨醇溶液重悬菌体细胞。
f. 4, ℃4000rpm离心5min收集菌体细胞，用1mL冰冷11mol⋅L-1山梨醇溶液重悬菌体细胞。置于冰上备用(也可将此感受态细胞分装200μL于离心管中冻存备用，但其转化效率将明显下降)。
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5楼2014-05-05 09:24:04
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