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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 微生物 » 发酵/表达 » 小试表达，中试不表达是什么原因
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cao534

银虫 (正式写手)

[求助] 小试表达，中试不表达是什么原因 已有3人参与

最近在做重组菌发酵，pet28a/BL21(DE3),氨苄抗性，摇瓶和10L发酵罐多次试验均有目的蛋白表达，但是做100L的时候发酵菌体收率比10L要高，但是菌体离心不实，也没有目的蛋白的表达，种子库使用的事甘油管，重组接摇瓶还是能表达，各位大侠知道是怎么回事吗？

[ Last edited by gyesang on 2014-4-3 at 11:55 ]
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1楼 2014-04-03 11:38:26
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lotusx

新虫 (初入文坛)

【答案】应助回帖

★ ★ ★
感谢参与，应助指数 +1
laozuzunzhe: 金币+2, 鼓励新虫应助！ 2014-05-07 23:31:46
cao534: 金币+1, ★有帮助 2014-06-06 08:41:52
菌体离心不实 可能是菌体老化了，自溶出来的蛋白酶把目的蛋白降解了~
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2楼2014-04-03 17:55:22
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cao534

银虫 (正式写手)
引用回帖:
2楼: Originally posted by lotusx at 2014-04-03 17:55:22
菌体离心不实 可能是菌体老化了，自溶出来的蛋白酶把目的蛋白降解了~

中间监控，诱导6h时也没有目的蛋白表达
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3楼2014-04-04 10:13:19
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wyz5527

铜虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

★ ★ ★ ★ ★
laozuzunzhe: 金币+3, 鼓励新虫应助！ 2014-05-07 23:32:11
cao534: 金币+2, ★★★很有帮助 2014-06-06 08:42:07
菌体离心不实我觉得不是老化自溶，反而是过快生长，况且发酵放大时，罐越大培养基浓度应当同比例适当降低，而不是同比例不变。再就是诱导剂添加时机、添加方式、添加量也影响比较大，毕竟诱导剂对菌来说是有毒性的
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简练才是真正的丰富
4楼2014-05-07 16:59:15
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wyz5527

铜虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

还有蛋白类的产物往往跟ph有很大关系，因为很多酶需要在某个ph产生、发生作用，尤其菌入罐初期，是合成相应酶系的关键时刻，不同的初始ph、氮源浓度（个人认为此时氮源起主要作用）会产生不同的酶系，对后面的产物有较大影响
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简练才是真正的丰富
5楼2014-05-07 17:04:10
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ganchao1776

至尊木虫 (职业作家)
现在做的怎么样呀，pET28a是卡那抗性的。
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6楼2014-06-05 09:57:59
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cao534

银虫 (正式写手)
引用回帖:
6楼: Originally posted by ganchao1776 at 2014-06-05 09:57:59
现在做的怎么样呀，pET28a是卡那抗性的。

现在问题解决了，不过新问题又来了
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7楼2014-06-05 16:04:03
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小花木兰

银虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

怎解决呀，现在有什么问题呢
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8楼2014-06-05 16:37:41
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cao534

银虫 (正式写手)
引用回帖:
8楼: Originally posted by 小花木兰 at 2014-06-05 16:37:41
怎解决呀，现在有什么问题呢

移种管路有1处死角，每次移种就会发生染菌，摇瓶做种子酒不会出现问题，但是最近不知怎么的，菌种张不起来，是新制备的感受态转化的菌体，接种后6-8h溶氧上升，菌体停止生长，种子检测过了没有我问题，培养基没有换过，离心收集少量的菌体，表达量也没有以前的高
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9楼2014-06-06 15:16:43
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