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绵羊全血提取DNA详细步骤已有1人参与
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包括试剂配制 注：哺乳动物DNA在白细胞内 红细胞无细胞核 已经尝试过四种方法 但是浓度始终处于20ng/ul左右 后期还要纯化PCR产物再酶切 这个浓度用loading buffer跑DNA条带几乎不显 很淡在下动物遗传小硕 求大神指点！！！在此拜过！！！！！！！！！！！！！！！！越详细越好！！！！！！ |
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youlinglyw
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【答案】应助回帖
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感谢参与，应助指数 +1
yyailxw0520(kx444555代发): 金币+5, 鼓励交流 2014-03-07 09:42:34
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yyailxw0520(kx444555代发): 金币+5, 鼓励交流 2014-03-07 09:42:34
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绵羊？人类的可不可以，大把大把的技术都有 1.新鲜抗凝血，离心弃去上清液； 2.取出4℃冰箱预冷的ELS裂解液，按1:6-10的比例向细胞沉淀中加入ELS裂解液（1ml细胞压积加入6-10ml裂解液），轻轻吹打混匀； 红细胞裂解液ELS配方： NH4Cl:4.15克加双蒸水500ml,取450ml; Tris:1.0297克加双蒸水50ml,再加上上面的450ml,共计500ml,高压灭菌, 用时加10-20ml 3.800-1000rpm离心5-8分钟，离心弃去上层红色清液； 4.收集沉淀部分，加入Hank’s液或无血清培养液离心洗2-3次； 5.如裂解不完全可重复步骤2和3； 6.重悬细胞，用于后续实验；提取DNA，最好是于步骤4开始使用DEPC水配制的溶液进行. 酚氯仿方法提取DNA 在DNA提取过程中应尽量避免使DNA断裂和降解的各种因素，以保证DNA的完整性，为后续的实验打下基础。是采用在EDTA以及SDS等试剂存在下用蛋白酶K消化细胞，随后用酚抽提而实现的。这一方法获得的DNA不仅经酶切后可用于Southern分析，还可用于PCR的模板、文库构建等实验。 原则：（1）防止和抑制DNase对DNA的降解；（2）尽量减少对溶液中DNA的机械剪切破坏。 一、试剂准备 1．TE: 10mM Tris-HCl (pH 7.8); 1mM EDTA (pH 8.0)。 2．TBS: 25mM Tris-HCl (pH 7.4); 200mM NaCl; 5mM KCl。 3．裂解缓冲液：250mM SDS; 使用前加入蛋白酶K至100mg/ml。 4．20% SDS 5．2mg/ml蛋白酶K 6．Tris饱和酚（pH 8.0）、酚/氯仿（酚∶氯仿=1∶1）、氯仿 7．无水乙醇、75%乙醇 二、操作步骤 （一）材料处理 1．白细胞处理 ⑴ 取红细胞裂解完全后收集的沉淀，加入0.5ml TE ⑵ 将匀浆液转移到1.5ml离心管中。 ⑶ 加20% SDS 25 μl，蛋白酶K (2mg/ml) 25 μl，混匀。 ⑷ 60°C水浴1-3hr。 2．培养细胞处理： ⑴ 将培养细胞悬浮后，用TBS洗涤一次。 ⑵ 离心4000g×5min，去除上清液。 ⑶ 加10倍体积的裂解缓冲液。 ⑷ 50-55°C水浴1-2hr。 （二）DNA提取 1. 加等体积饱和酚至上述样品处理液中，温和、充分混匀3min。 2. 离心5000g×10min，取上层水相到另一1.5ml离心管中。 3. 加等体积饱和酚，混匀，离心5000g×10min，取上层水相到另一管中。 4. 加等体积酚/氯仿，轻轻混匀，离心5000g×10min，取上层水相到另一管中。如水相仍不澄清，可重复此步骤数次。 5. 加等体积氯仿，轻轻混匀，离心5000g×10min，取上层水相到另一管中。 6. 加1/10体积的3M醋酸钠（pH 5.2）和2.5倍体积的无水乙醇，轻轻倒置混匀。 7. 待絮状物出现后，离心5000g×5min，弃上清液。 8. 沉淀用75%乙醇洗涤，离心5000g×3min ，弃上清液。 9. 室温下挥发乙醇，待沉淀将近透明后加50-100ml TE溶解过夜。 (三）DNA定量和电泳检测 1.DNA定量： DNA在260nm处有最大的吸收峰，蛋白质在280nm处有最大的吸收峰，盐和小分子则集中在230nm处。因此，可以用260nm波长进行分光测定DNA浓度，OD值为1相当于大约50μg/ml双链DNA。如用1cm光径，用 H2O稀释DNA样品n倍并以H2O为空白对照，根据此时读出的OD260值即可计算出样品稀释前的浓度：DNA（mg/ml）=50×OD260读数×稀释倍数/1000。 DNA纯品的OD260/OD280为1.8，故根据OD260/OD280的值可以估计DNA的纯度。若比值较高说明含有RNA，比值较低说明有残余蛋白质存在。OD230/OD260的比值应在0.4-0.5之间，若比值较高说明有残余的盐存在。 2.电泳检测： 取1μg基因组DNA用行0.8%琼脂糖凝胶上电泳，检测DNA的完整性，或多个样品的浓度是否相同。电泳结束后在点样孔附近应有单一的高分子量条带。 三、注意事项 1. 所有用品均需要高温高压，以灭活残余的DNA酶。 2. 所有试剂均用高压灭菌双蒸水配制。 3. 用大口滴管或吸头操作，以尽量减少打断DNA的可能性。 4. 用上述方法提取的DNA纯度可以满足一般实验（如Southern 杂交、PCR等）目的。如要求更高，可参考有关资料进行DNA纯化。 |
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