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xiao宁

新虫 (初入文坛)

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[求助] 300bp左右的序列，两端酶切位点相同能否发生自连

最近在构思下一步试验方案，但是遇到一个问题：
我打算扩增启动子以及后面的干扰片段设计引物时给两端加同样的酶切位点设计好后进行PCR扩增扩增产物经酶切后与线性载体进行连接
现在有个问题扩增后的产物经酶切后会发生自连形成300bp左右的环状？

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1楼 2014-03-06 12:19:26

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atlanticwi

金虫 (正式写手)

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★ ★
西门吹雪170: 金币+2, 鼓励回帖交流 2014-03-06 15:40:13

.............
不知是否非要这样做。
如果是，你更需要关心的是载体自连，防止载体自连可以用CIP处理。
片段就算自连，转化大肠杆菌后，也会被抗性、及大肠杆菌自身的复制机制筛选掉。如果你还是觉得闹心的话。使用PEG-4000（好像是4000）可以抑制环化现象。PEG的作用主要是促进连接反应中的线性连接以及多聚化产生。在Thermo系列的连接酶中都附带有PEG的。但你需要注意的是，可能会有多聚体连入你的载体，因为你300bp实在太小了。
祝实验顺利

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Let God do with it as He wills

2楼2014-03-06 13:47:20