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CM-sepharose填料处理方法 已有1人参与
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| 我从蘑菇中用沉淀法得到粗蛋白，但是含有很多色素，貌似是阳离子交换层析时色素的影响不大，现在有CM-sepharose填料，但型号未知，但想试试。可是不知道怎么进行填料预处理。请各位帮帮忙告知具体的处理方法，谢谢！ |
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yipan 
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【答案】应助回帖
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一、准备： CM Sepharose Fast Flow用20％乙醇贮存。将匀浆中乙醇轻轻倒出，用starting buffer代替，使Sepharose与starting buffer的比例分别为75％和25％。（starting buffer中不应含有明显增加其粘性的物质）。在装柱结束后，柱子应当用递减流速的粘性缓冲液来平衡。 二、装柱： 1．平衡各物质至工作温度。 2．从胶匀浆中去除气体。 3．用缓冲液冲洗柱子末端以排除死腔中的气体。确保柱子过滤网中不含气体。关闭柱子出口，并使柱子里含有几厘米高度的缓冲液。 4．将匀浆连续倒入柱子中。可以用一根玻璃棒斜靠在柱子壁上，使匀浆沿玻璃棒流入以减少气泡的产生。 5．立即用缓冲液装满柱子的剩余部分，装上柱子顶部的装置，并与蠕动泵相连。 6．将柱子与缓冲液相连，打开柱子底部开关和蠕动泵，以持续的目标流速（至少400cm/h，如果达不到则以机器的最大流速进行）将胶压紧。（注：后面的操作不得超过该流速的75％。） 7．在胶床稳定后保持该流速，直到流过3倍胶床体积的缓冲液。 【使用活塞】： 1．根据上述方法装柱后，关闭底部出口，移去柱子顶部装置，小心倒满柱子至顶部，使液体由于张力而形成上弦的形状。 2．将活塞以一定的角度插入柱中，确保活塞底部的网中没有气体。 3．在此步骤中将各管道相连，确保缓冲液中不含气体。 4．缓慢将活塞滑入柱中，从而使活塞网上方以及管中的气体渐渐被液体代替。入口处的阀应转向各个方向以确保排除气体。 5．锁定活塞，打开柱子出口，以装柱流速将缓冲液过柱至胶床稳定。（必要时重新调整活塞位置。） 三、平衡： 在开始纯化之前，确保离子交换胶床已被平衡。starting buffer在入柱前及流出后的传导性和/或PH相同则说明柱子已经平衡，可以开始使用了。 |
2楼2014-02-25 16:36:34
3楼2014-02-26 18:22:11