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问问做qPCR时，探针怎么设计？在设计时有什么要求？ 在合成时，那几个荧光基团好用？ |
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yipan 
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3楼2014-02-18 10:11:14
yipan
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【答案】应助回帖
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感谢参与，应助指数 +1
kx444555: 金币+3, 鼓励交流 2014-02-18 11:47:02
爱上鱼……: 金币+3, ★有帮助, 多谢，探针设计有专门的软件没有，有没有推荐下的？ 2014-02-20 15:09:53
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爱上鱼……: 金币+3, ★有帮助, 多谢，探针设计有专门的软件没有，有没有推荐下的？ 2014-02-20 15:09:53
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Taqman@探针是最早用于定量的方法。就在PCR扩增时加入一对引物的同时加入一个特异性的荧光探针，该探针 为一寡核苷酸：5’端标记一个报告荧光基团，3’端标记一个淬灭荧光基团。探针完整时，报告基团发射的荧光信号被淬灭基团吸收，也就是FRET反 应；PCR扩增时，Taq酶的5'-3'外切酶活性将探针酶切降解，使报告荧光基团和淬灭荧光基团分离，从而荧光监测系统可接收到荧光信号，即每扩增一条 DNA链，就有一个荧光分子形成，实现了荧光信号的累积与PCR产物形成完全同步。而新型TaqMan-MGB探针使该技术既可进行基因定量分析，又可分 析基因突变（SNP），有望成为基因诊断和个体化用药分析的首选技术平台。 一般real-time PCR引物的设计遵循下面一些原则： 扩增产物长度在80-150bp。 引物应用核酸系列保守区内设计并具有特异性。 产物不能形成二级结构。 产物长度一般在15-30碱基之间。 G+C含量在40%-60%之间。 碱基要随机分布。 引物自身不能有连续4个碱基的互补。 引物之间不能有连续4个碱基的互补。 引物5’端可以修饰。 引物3’端不可修饰。 引物3’端要避开密码子的第3位。 Taqman@探针的设计稍有不同，一般有公司设计合成。遵循下面以下原则： 尽量靠在上游引物； 长度30-45bp，Tm比引物高至少5℃； 5’端不要是G，G会有淬灭作用，影响定量 |
2楼2014-02-18 10:09:30
jiaolong11a
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4楼2014-02-18 10:40:26
5楼2014-02-20 15:12:21