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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » PCR相关 » 探针设计
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爱上鱼……

银虫 (小有名气)

[求助] 探针设计已有2人参与

问问做qPCR时，探针怎么设计？在设计时有什么要求？
在合成时，那几个荧光基团好用？
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懒病又犯了……
1楼2014-02-18 09:43:33
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yipan

铜虫 (职业作家)

【答案】应助回帖

★ ★ ★ ★ ★ ★
感谢参与，应助指数 +1
kx444555: 金币+3, 鼓励交流 2014-02-18 11:47:02
爱上鱼……: 金币+3, ★有帮助, 多谢，探针设计有专门的软件没有，有没有推荐下的？ 2014-02-20 15:09:53
Taqman@探针是最早用于定量的方法。就在PCR扩增时加入一对引物的同时加入一个特异性的荧光探针，该探针 为一寡核苷酸：5’端标记一个报告荧光基团，3’端标记一个淬灭荧光基团。探针完整时，报告基团发射的荧光信号被淬灭基团吸收，也就是FRET反 应；PCR扩增时，Taq酶的5'-3'外切酶活性将探针酶切降解，使报告荧光基团和淬灭荧光基团分离，从而荧光监测系统可接收到荧光信号，即每扩增一条 DNA链，就有一个荧光分子形成，实现了荧光信号的累积与PCR产物形成完全同步。而新型TaqMan-MGB探针使该技术既可进行基因定量分析，又可分 析基因突变（SNP），有望成为基因诊断和个体化用药分析的首选技术平台。   
一般real-time PCR引物的设计遵循下面一些原则：
  扩增产物长度在80-150bp。
  引物应用核酸系列保守区内设计并具有特异性。
  产物不能形成二级结构。
  产物长度一般在15-30碱基之间。
  G+C含量在40%-60%之间。
  碱基要随机分布。
  引物自身不能有连续4个碱基的互补。
  引物之间不能有连续4个碱基的互补。
  引物5’端可以修饰。
  引物3’端不可修饰。
  引物3’端要避开密码子的第3位。
        Taqman@探针的设计稍有不同，一般有公司设计合成。遵循下面以下原则：
  尽量靠在上游引物；
  长度30-45bp，Tm比引物高至少5℃；
  5’端不要是G，G会有淬灭作用，影响定量
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2楼2014-02-18 10:09:30
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yipan

铜虫 (职业作家)

【答案】应助回帖

★ ★ ★ ★
kx444555: 金币+1, 鼓励交流 2014-02-18 11:47:07
爱上鱼……: 金币+3, ★★★很有帮助 2014-02-20 15:11:16
Taqman探针常用荧光基团FAM标记荧光基团和TAMRA标记
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3楼2014-02-18 10:11:14
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jiaolong11a

新虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

感谢参与，应助指数 +1
网上搜一下很多的撒
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多情总被无情扰。。。愁
4楼2014-02-18 10:40:26
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爱上鱼……

银虫 (小有名气)
引用回帖:
3楼: Originally posted by yipan at 2014-02-18 10:11:14
Taqman探针常用荧光基团FAM标记荧光基团和TAMRA标记

5端用TAM,3端用FAM么？
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懒病又犯了……
5楼2014-02-20 15:12:21
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yipan

铜虫 (职业作家)

【答案】应助回帖

★ ★
爱上鱼……: 金币+2, ★★★很有帮助 2014-02-20 15:31:03
引用回帖:
5楼: Originally posted by 爱上鱼…… at 2014-02-20 15:12:21
5端用TAM,3端用FAM么？...

5‘荧光基团用FAM标记    3‘荧光基团用TAMRA标记
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6楼2014-02-20 15:19:49
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yipan

铜虫 (职业作家)

【答案】应助回帖

★ ★
爱上鱼……: 金币+2, ★★★很有帮助 2014-02-20 15:31:16
引用回帖:
6楼: Originally posted by yipan at 2014-02-20 15:19:49
5‘荧光基团用FAM标记    3‘荧光基团用TAMRA标记...

Beacon Designer 7.91 Demo TaqMan探针设计软件
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7楼2014-02-20 15:21:56
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