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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 生物科学 » 蛋白电泳/WB » 从细菌提取一种功能蛋白，跑非变性PAGE胶无法进入胶体
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cisong

银虫 (小有名气)

[求助] 从细菌提取一种功能蛋白，跑非变性PAGE胶无法进入胶体 已有2人参与

本人想从一种细菌的菌体中提取一个新的蛋白做质谱鉴定，目前只知道该蛋白的功能，但是对于蛋白的种类、分子量大小等信息都不知道。菌体用含裂解缓冲液悬浮。裂解缓冲液含有5%的甘油、20mM的Tris-Hcl（pH8.0-8.8）、50mM的NaCl。然后用高压破碎4次，压力足够大。破碎后裂解液经过13000rpm离心5分钟，取上清液直接上样做蛋白电泳，期待目标蛋白能分开。电泳采用非变性PAGE，胶浓度已调至最低4%，跑胶结束后检测胶内活性，检测结果显示目标蛋白在上样槽底部，未进入胶体。说明该蛋白的水溶解性很差。
后期为了提高溶解性，单独考察了温度（4℃、15℃、30℃）、pH（4.8-12.8）、NaCl（0-2M）浓度对该蛋白的溶解性是否有促进作用，结果均失败。
后来，添加分别单独添加多种去污剂（Triton X-100、Triton X-114、CHAPS、LDAO、OG、DDM），添加时采用溶解浓度，即10倍的CMC浓度，但是效果也很差，只有DDM有微量的促进作用，但是因效果太有限，并且太贵而终止。

问题是，在上述操作中，是否有什么不规范的操作？还有就是如何在保证蛋白活性的前提下，促进难溶解蛋白的水溶性？谢谢！

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科研工作者
1楼 2014-02-13 23:59:03
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yang0071

木虫 (职业作家)
引用回帖:
7楼: Originally posted by cisong at 2014-02-14 10:24:59
一般添加什么油和有机溶剂啊？浓度范围是多少啊？谢谢！...

你先试试丙酮吧，做个梯度浓度
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8楼2014-02-14 10:48:23
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yang0071

木虫 (职业作家)

【答案】应助回帖

★ ★ ★
感谢参与，应助指数 +1
cisong(kx444555代发): 金币+3, 鼓励交流 2014-02-14 09:07:06
水容不了就用油溶
实在不行，上有机溶剂或者直接乙醇溶
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2楼2014-02-14 08:22:18
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cisong

银虫 (小有名气)
引用回帖:
2楼: Originally posted by yang0071 at 2014-02-14 08:22:18
水容不了就用油溶
实在不行，上有机溶剂或者直接乙醇溶

用油、有机溶剂会不会影响到蛋白活性啊？
赞一下 回复此楼
科研工作者
3楼2014-02-14 08:29:27
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yang0071

木虫 (职业作家)
引用回帖:
3楼: Originally posted by cisong at 2014-02-14 08:29:27
用油、有机溶剂会不会影响到蛋白活性啊？...

你试试就知道了
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cisong
4楼2014-02-14 09:01:29
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