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从细菌提取一种功能蛋白，跑非变性PAGE胶无法进入胶体已有2人参与
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本人想从一种细菌的菌体中提取一个新的蛋白做质谱鉴定，目前只知道该蛋白的功能，但是对于蛋白的种类、分子量大小等信息都不知道。菌体用含裂解缓冲液悬浮。裂解缓冲液含有5%的甘油、20mM的Tris-Hcl（pH8.0-8.8）、50mM的NaCl。然后用高压破碎4次，压力足够大。破碎后裂解液经过13000rpm离心5分钟，取上清液直接上样做蛋白电泳，期待目标蛋白能分开。电泳采用非变性PAGE，胶浓度已调至最低4%，跑胶结束后检测胶内活性，检测结果显示目标蛋白在上样槽底部，未进入胶体。说明该蛋白的水溶解性很差。 后期为了提高溶解性，单独考察了温度（4℃、15℃、30℃）、pH（4.8-12.8）、NaCl（0-2M）浓度对该蛋白的溶解性是否有促进作用，结果均失败。 后来，添加分别单独添加多种去污剂（Triton X-100、Triton X-114、CHAPS、LDAO、OG、DDM），添加时采用溶解浓度，即10倍的CMC浓度，但是效果也很差，只有DDM有微量的促进作用，但是因效果太有限，并且太贵而终止。 问题是，在上述操作中，是否有什么不规范的操作？还有就是如何在保证蛋白活性的前提下，促进难溶解蛋白的水溶性？谢谢！ 将依据回答者的帮助程度奖励金币。 |
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yang0071
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2楼2014-02-14 08:22:18
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yang0071
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【答案】应助回帖
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你做质谱为什么要跑非变性胶? 质谱最后怎么都要把蛋白水解成多肽啊. 而且这蛋白的等电点也不知道,万一蛋白在缓冲液里是带正电荷的,那你用正常的电泳接法肯定进不去胶啊. 再说了,你这蛋白是和其他蛋白形成复合体还是和核酸相互作用也不知道,你咋判断是哪个条带呢? 我觉得你要是能检测胶内活性,你就直接用和这个蛋白相互作用的底物或者什么东西把蛋白pulldown,然后跑变性胶送去做质谱好了,甚至pulldown以后不跑胶也行 最后,具体回答你的问题来说,有时候加点BME破坏二硫键的形成,会帮助蛋白进入非变性胶 |
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5楼2014-02-14 09:09:32
送红花一朵|
谢谢你的建议。 跑非变性胶是原因是要在保留该蛋白活性，这样就可以在胶内初步分离的同时检测哪个条带是目标蛋白，因为在检测胶内活性的时候目标蛋白条带会显色，而变性胶的话会因蛋白失活而无法使目标蛋白条带显色。 关于电荷的问题，我曾经将电泳的电极互换，结果上样槽底部也没有目标蛋白条带，说明该蛋白在缓冲液条件下还是带负电的，另外，添加去污剂的条件下，会有少量目标蛋白进入胶体，也说明是负电的。 关于蛋白复合体和核酸互作的问题，没有考虑到。希望能得到您的进一步指导。是否需要添加核酸水解酶将破碎液中的核酸水解？ 关于pulldown的问题，我没有做过，不知道步骤麻烦不？底物是一个重金属，该蛋白可以改变该重金属的价态而使得底物在蛋白条带处显色，不知道是否可以用pulldown的做法？ BME是指β-巯基乙醇，我以前也加过类似的东西，比如DTT，好像效果不明显。我再添加BME试一试。 总之谢谢啦！  |
6楼2014-02-14 10:22:26
7楼2014-02-14 10:24:59
yang0071
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8楼2014-02-14 10:48:23