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bobcanada至尊木虫 (文坛精英)
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HPLC问题求助高手 已有3人参与
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2000年购买的Bio-Rad 公司的Biologic DuoFlow Chromatography System，一直用于分析蛋白质（凝胶色谱及离子交换色谱）。最近3－4年没有人使用了，一直闲置。现在想用于反相HPLC分析，所以新买了C18色谱柱，但还没有连接上C18色谱柱。准备先试验一下系统是否还工作。遇到了麻烦。 流动相A: 0.1% TFA/水；流动相B: 0.1% 乙腈。使用前，2个流动相溶液都分别用超声波清洗器做15分钟脱气处理。 开始试验系统。流动相：A 90%， B 10%，走3分钟；然后A从 90%到0%， B从 10%到100%，走25分钟。 可以看到，没有连接色谱柱的情况下，色谱图出现很多峰，特别是在走梯度的时候。如果单纯走水，没有这些峰。 水占90%的时候，峰也很少。好像是每间隔2分钟，就出1个峰。是气泡峰吗？还是以前管线里面沉积的蛋白残留物？ 本人没有操作过HPLC，是新手，身边没有人请教。现请教小木虫上都专家和高手，怎么解决？万分感谢！  HPLC-BioLogic DuoFlow.PNG |
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bobcanada
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A、B两相以前都用的是水，没有任何杂峰出现。 我们隔壁实验室的这台Bio-rad 公司的Biologic DuoFlow 色谱系统，其实主要是用于蛋白分离的中压色谱，特别是离子交换和凝胶（排阻）色谱，是2000年12月购买的，已经13年了，一直用于蛋白的分离。最近我们实验室需要分离小分子多肽，没有HPLC，就准备把这台Bio-rad 公司的的FPLC（快速蛋白液相色谱）用于反相HPLC的分离工作。根据说明书，这台仪器的泵压可以达到HPLC泵的水平，可以连接上反相C18柱，作为反相HPLC使用。 4年前有人用过这台仪器，后来就一直闲置在一旁。由于以前操作人员早已离开，没有人请教，我自己摸索了一段时间，才弄明白如何使用。A、B两相都是用纯水做流动相进行试验的，仪器一切正常。这样，我才订购了比较便宜的HPLC专用乙腈和甲醇（EMD公司），又买了一根C18反相分析柱。由于担心系统管路不干净，弄脏新买的C18反相分析柱，所以没有接上柱子，只是单纯地跑0.1%TFA/水及0.1%TFA/乙腈，看看是否正常，结果发现开始梯度时，很多的杂峰。昨天，我又用0.1%TFA/水及纯甲醇走梯度，好像杂峰更多。 我想乙腈和甲醇都是HPLC级别的专用溶剂，即使质量有可能有问题，不会出这么多的峰吧？如果说是系统管路不干净，在没有连接色谱柱的情况下，管路内壁可以存留那么多的杂质吗？上上周我已经用水和乙腈冲洗（正、反梯度）过一周的管路了，情况没有任何改善。是否是气泡的原因呢？ 下周，我准备单纯用乙腈、甲醇、异丙醇冲洗管路，看看是否有峰出来。 |
16楼2014-02-09 03:38:58
whynotbest
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2楼2014-02-08 02:04:24
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乙腈是EMD公司的HPLC专用乙腈。 产品订购来源： https://ca.vwr.com/store/catalog ... g_number=CAAX0145-1 产品检验报告：https://ca.vwr.com/stibo/hi_res/10646475.pdf |
3楼2014-02-08 02:42:16
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4楼2014-02-08 02:48:08
