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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » 综合其他 » 关于cloning用的DNA polymerase，急~求助大侠们~~
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seo.d_park

木虫 (正式写手)

[求助] 关于cloning用的DNA polymerase，急~求助大侠们~~ 已有3人参与

一直在用rTaq (takara)的DNAPolymerase 做Cloning的 insert PCR 扩增，结果sequencing 后老是有4~5个mutation.
所以想换个DNA polymerase用用，目的扩增的DNA片段最大不到1Kb,听说Pfu Polymerase 好用，所以想用试试。
但是看这个说明书上Application写的适用于Blunt end form cloning,但是我用的enzyme是 stick enzyme,哪位大侠能告诉我得用什么Enzyme啊~
着急啊~！！
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1楼 2014-01-22 21:03:37
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DAX1

新虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

★ ★
感谢参与，应助指数 +1
gyesang: 金币+1, 鼓励交流！ 2014-01-23 11:04:27
seo.d_park: 金币+1 2014-01-23 11:16:09
lataq,extaq,都是taq酶，扩增会有个a，应该符合你的要求
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2楼2014-01-22 22:25:58
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zqybyy

木虫 (著名写手)

Dr

【答案】应助回帖

★ ★ ★
感谢参与，应助指数 +1
gyesang: 金币+2, 鼓励交流！ 2014-01-23 11:04:32
seo.d_park: 金币+1 2014-01-23 11:16:06
1. 降低Mg++离子浓度。
2. 减少PCR扩增循环数。
3. 提高退火温度。
4.更换Taq酶，若是末尾不加A的，可对产物加A处理。
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3楼2014-01-22 23:57:57
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zhaozhibozhi

金虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

★ ★ ★ ★ ★ ★
感谢参与，应助指数 +1
gyesang: 金币+3, 鼓励交流！ 2014-01-23 11:04:41
seo.d_park: 金币+3 2014-01-23 11:16:12
1kb片段的话，产生突变的几率不应该那么高，解决方案如下：
1）仍然使用常规的Taq酶，pcr时适当增加退火温度、降低循环次数；
2）使用高保真酶，如FastPfu，PCR后作加A尾处理，就可以做TA克隆了；有专门的加A试剂盒，或者增加一个加A步骤。
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做一个阳光、开朗的小和尚
4楼2014-01-23 09:38:11
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seo.d_park

木虫 (正式写手)
引用回帖:
4楼: Originally posted by zhaozhibozhi at 2014-01-23 09:38:11
1kb片段的话，产生突变的几率不应该那么高，解决方案如下：
1）仍然使用常规的Taq酶，pcr时适当增加退火温度、降低循环次数；
2）使用高保真酶，如FastPfu，PCR后作加A尾处理，就可以做TA克隆了；有专门的加A试剂 ...

谢谢高手指点哈~那就是说Pfu 不管是blunt 还是 stick都能使用是么？
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5楼2014-01-23 11:15:44
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zhaozhibozhi

金虫 (正式写手)
引用回帖:
5楼: Originally posted by seo.d_park at 2014-01-23 11:15:44
谢谢高手指点哈~那就是说Pfu 不管是blunt 还是 stick都能使用是么？...

使用pfu酶扩增的话，由于该酶有3‘-5’的外切活性，所以PCR产物为平末端（blunt），没有A尾；可以直接连在平末端载体上。如果想做TA克隆，需要加个A尾，形成粘性末端（stick）。
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做一个阳光、开朗的小和尚
6楼2014-01-23 12:28:49
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Lau_Kimura

铁虫 (正式写手)
★
gyesang: 金币+1, 鼓励交流！ 2014-01-25 03:53:57
KOD Fx高保真酶，经常扩增2kb的启动子构建GUS载体，表示非常好用。
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7楼2014-01-24 23:14:33
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gyesang

荣誉版主 (著名写手)

优秀版主优秀版主
做克隆一般用高保真酶，如PFU，KOD等，他们由于有3'到5'的外切酶活性，所以扩增出来的片段是平断，但这跟你用Sticky酶没有任何关系，你可以把PCR产物和载体分别双酶切然后连接

[ 发自手机版 http://muchong.com/3g ]
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学术问题讨论咨询发邮件gyesang@163.com
8楼2014-01-25 03:58:29
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treetreew

木虫 (小有名气)
换高保真

粘性末端另外加
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9楼2014-01-26 10:24:51
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