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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 生物科学 » 【求助】急急急！如何区分共聚焦显微镜拍出的荧光是绿色荧光蛋白还是细胞自身荧光
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zhangying720

新虫 (初入文坛)

[求助] 【求助】急急急！如何区分共聚焦显微镜拍出的荧光是绿色荧光蛋白还是细胞自身荧光 已有3人参与

本人是有机化学专业，最近在用自己的化合物做细胞转染，如图（暗场+明场），用的是A549细胞，转染拍出的荧光集中在细胞周围，这是正常现象吗？还是是细胞的自身荧光，怎么区分呢？我做了lip2000，是整个细胞都有绿色荧光，为什么我的是这样的呢？如果说是自身荧光的话，为什么我的其他化合物什么荧光都看不到呢？在此向各位前辈求助，谢谢了！！!
【求助】急急急！如何区分共聚焦显微镜拍出的荧光是绿色荧光蛋白还是细胞自身荧光[/img]
【求助】急急急！如何区分共聚焦显微镜拍出的荧光是绿色荧光蛋白还是细胞自身荧光-1[/img]
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1楼 2014-01-20 18:12:27
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percoll

新虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

★ ★
感谢参与，应助指数 +1
zhangying720: 金币+2, ★有帮助 2014-01-25 15:17:25
应该不是细胞自身荧光，细胞自身荧光应该很弱，而且分布很弥散，你的图片中荧光在细胞内的分布并不是很均匀，而且比较亮，所以应该不是自身荧光。
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2楼2014-01-20 19:12:36
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zhangying720

新虫 (初入文坛)
引用回帖:
2楼: Originally posted by percoll at 2014-01-20 19:12:36
应该不是细胞自身荧光，细胞自身荧光应该很弱，而且分布很弥散，你的图片中荧光在细胞内的分布并不是很均匀，而且比较亮，所以应该不是自身荧光。

谢谢亲的回答，亲觉得是表达出来的绿色荧光蛋白是吗？为什么会这样分布呢？商品化的lip2000看着像是整个细胞都有很强的荧光
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3楼2014-01-20 20:37:55
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yang0071

木虫 (职业作家)

【答案】应助回帖

感谢参与，应助指数 +1
证明你的蛋白在包浆中弥散分布
没有特异性
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4楼2014-01-21 10:29:28
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zhangying720

新虫 (初入文坛)
引用回帖:
4楼: Originally posted by yang0071 at 2014-01-21 10:29:28
证明你的蛋白在包浆中弥散分布
没有特异性

没有特异性？不太明白，楼上能具体解释一下吗？拜托了，谢谢！
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5楼2014-01-21 10:57:42
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percoll

新虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

楼主是只转的GFP吗？我只知道lipo2000对于难转的细胞，有时转染出来也是这样子，感觉荧光不是很均匀，所以我觉得你自己的试剂的转染效果应该不是很好。建议楼主最好用GFP抗体做western检测一下，这样就放心了。
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6楼2014-01-21 14:28:15
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zhangying720

新虫 (初入文坛)
引用回帖:
6楼: Originally posted by percoll at 2014-01-21 14:28:15
楼主是只转的GFP吗？我只知道lipo2000对于难转的细胞，有时转染出来也是这样子，感觉荧光不是很均匀，所以我觉得你自己的试剂的转染效果应该不是很好。建议楼主最好用GFP抗体做western检测一下，这样就放心了。

嗯，我的试剂的转染效果是不太好，我是做有机合成的，只是最后做性质时看一下转染效果，目前就想确定一下它确实转染进去了，不是细胞自身荧光就行，我还用FITC-DNA拍过跨膜，能在细胞里看到亮点，但细胞核里很少。网上查的GFP抗体做western检测上好复杂啊，什么材料仪器步骤都没有，估计来不及做了。lipo2000对于难转的细胞也会出现这样的转染效果吗？
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7楼2014-01-21 14:55:51
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percoll

新虫 (小有名气)
引用回帖:
7楼: Originally posted by zhangying720 at 2014-01-21 14:55:51
嗯，我的试剂的转染效果是不太好，我是做有机合成的，只是最后做性质时看一下转染效果，目前就想确定一下它确实转染进去了，不是细胞自身荧光就行，我还用FITC-DNA拍过跨膜，能在细胞里看到亮点，但细胞核里很少。 ...

应该是，而且荧光照片的效果跟你制爬片及封片的细节也有关系，western如果自己实验室做不了的话也可以外包给公司，估计也就两三百块钱。
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8楼2014-01-21 20:15:10
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zhangying720

新虫 (初入文坛)
引用回帖:
8楼: Originally posted by percoll at 2014-01-21 20:15:10
应该是，而且荧光照片的效果跟你制爬片及封片的细节也有关系，western如果自己实验室做不了的话也可以外包给公司，估计也就两三百块钱。...

我的是直接在共聚焦培养皿里种细胞，加样拍照的，没有爬片封片。外包给公司的话，楼上有什么比较可靠的公司推荐吗？谢谢了
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9楼2014-01-22 10:40:22
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hl16010921

木虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

感谢参与，应助指数 +1
LZ用没转GFP的细胞作空白对照，调显微镜，空白对照有自体荧光。所以激发状态下调到对照看不到，转染细胞有荧光就OK了。
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10楼2014-01-22 10:40:42
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