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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » PCR相关 » PCR测序
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zwjxyzcl

铁虫 (初入文坛)

[求助] PCR测序 已有4人参与

小弟想克隆基因的CDS区 长约3000bp 设计了引物24nt长度 BLAST也没见特异性 克隆的产物位置我看挺对的 但克隆到T载体送测序（正向）测序结果blast下却发现并不是目的条带  克隆到T载体后我跑过电泳 也确定是连上去了 怎么会这样呢 要说引物设计不好吧 但P全长的话本身引物就比较受限 想问下各位虫子如何是好。。。。。好伤 感觉不会再爱了
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1楼 2014-01-20 15:16:58
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朱多龙

木虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

★ ★
感谢参与，应助指数 +1
gyesang: 金币+2, 鼓励交流！ 2014-01-20 16:03:00
克隆后连到T载体上的序列没有所谓的正向反向，所以你测序的结果最后给反向互补一下，再同时进行序列比对。你难道不知道你的基因序列，用的是简并引物进行的克隆？
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2楼2014-01-20 15:40:20
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yb19841014

铁杆木虫 (著名写手)

【答案】应助回帖

感谢参与，应助指数 +1
也可能是测序引物用错了吧  我以前遇到过一次
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3楼2014-01-20 17:25:32
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cicelyzh

铁杆木虫 (职业作家)

【答案】应助回帖

感谢参与，应助指数 +1
T-载体克隆两个方向都有可能的，你可以用T载体通用引物测序，这样可以确定目的片段连上去的方向。
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4楼2014-01-21 04:07:51
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lvbobo823

铁杆木虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

感谢参与，应助指数 +1
你在你克隆的片段里再做一个巢式PCR确定一下是不是你所需要的目的片段。你多合成些引物克隆目的片段。
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hehe
5楼2014-01-21 08:09:29
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zwjxyzcl

铁虫 (初入文坛)
引用回帖:
3楼: Originally posted by yb19841014 at 2014-01-20 17:25:32
也可能是测序引物用错了吧  我以前遇到过一次

用的是T载体的公共引物 测序公司提供
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6楼2014-01-21 20:10:27
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zwjxyzcl

铁虫 (初入文坛)
引用回帖:
2楼: Originally posted by 朱多龙 at 2014-01-20 15:40:20
克隆后连到T载体上的序列没有所谓的正向反向，所以你测序的结果最后给反向互补一下，再同时进行序列比对。你难道不知道你的基因序列，用的是简并引物进行的克隆？

什么叫简并引物哈？
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7楼2014-01-21 20:11:43
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zwjxyzcl

铁虫 (初入文坛)
引用回帖:
5楼: Originally posted by lvbobo823 at 2014-01-21 08:09:29
你在你克隆的片段里再做一个巢式PCR确定一下是不是你所需要的目的片段。你多合成些引物克隆目的片段。

嗯 明天试试
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8楼2014-01-21 20:12:48
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