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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » 综合其他 » 求助在载体构建过程中，信号肽与GFP的引物设计、启动子切除以及读码框的问题
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我是传奇456

金虫 (正式写手)

[求助] 求助在载体构建过程中，信号肽与GFP的引物设计、启动子切除以及读码框的问题 已有1人参与

RT，GFP载体已经构建好，现在想引入能够定位亚细胞器的信号肽，特来求助，有如下几个问题：
1.结构方面，信号肽肯定是位于GFP之前，那么，信号肽与GFP是否需要分成两段分别导入载体？还是需要将信号肽与GFP融合成一段后再导入？如果是两段的话，信号肽与GFP之间能否有间隔？
2.引物设计方面，信号肽的下游引物所设计的酶切位点，是否要与GFP的上游引物酶切位点保持一样？
3.关于启动子，我所导入的信号肽并没有ATG这个序列，是否能成功转录？而GFP上自带的ATG启动子是否需要切除掉？不切除的话是否有影响？
4.ORF，一段ORF是否就是从第一个启动子到第一个终止子这一段所表达的内容？如果此ORF中间部分含有启动子是否影响？

盼大神解惑！谢谢！
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1楼 2014-01-08 14:55:06
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lvbobo823

铁杆木虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

信号肽没有ATG没法翻译成信号肽若你载体上有ATG并且与信号肽序列 in frame可以不用。GFP加吧因为ATG就是一种氨基酸编码对影响不大。片段小也好连。但做搭桥PCR效果会更好些。你这样设计也可以，不过酶切位点过多会很麻烦的，建议在信号肽前加一个酶切位点，GFP后面加一个酶切位点，中间设计个引物让信号肽和GFP重合20bp左右。做一个overlap PCR就可以了
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hehe
4楼2014-01-10 10:33:39
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lvbobo823

铁杆木虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★
感谢参与，应助指数 +1
gyesang: 金币+5, 鼓励交流！ 2014-01-08 19:05:01
我是传奇456: 金币+10, ★有帮助, 感谢回答！不过还有一些不甚明了。 2014-01-10 10:17:16
我认为做定位你的GFP应与信号肽连在一块。第二问题我觉得只要不产生终止密码子或造成GFP编码的移位，酶切位点无所谓，但你酶切位点不一样怎样连接这两片段？第三，转录没问题；但翻译就不行了。第四，ORF中间有启动子序列影响到通读。
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hehe
2楼2014-01-08 18:00:40
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lingbi

银虫 (正式写手)
引用回帖:
2楼: Originally posted by lvbobo823 at 2014-01-08 18:00:40
我认为做定位你的GFP应与信号肽连在一块。第二问题我觉得只要不产生终止密码子或造成GFP编码的移位，酶切位点无所谓，但你酶切位点不一样怎样连接这两片段？第三，转录没问题；但翻译就不行了。第四，ORF中间有启动 ...

这个问题我也不太懂，你能再详细给说说吗，先谢谢了。

1、信号肽+GFP 融合表达，是两个都有ATG呢，还是信号肽加ATG，目的基因GFP可加可不加？
2、信号肽与GFP 连在一起可以PCR，也可以设酶切位用连接吧，只是片段太小好不好连？通常怎么做最合适 我想 酶切位点1+信号肽+酶切位点2+酶切位点3+GFP+酶切位点4  这样既可以PCR又能够连接反应，不知道是否可行？

麻烦高手给解答下呗
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3楼2014-01-09 23:13:44
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