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寻找感受态制备的好方法
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最近我们实验室的感受态细胞一直都做的不好，最可怕的就是现做现用还可以 ，但是一放到-70度冰箱再拿出来使用就不行了，连原质粒转化都不长斑。不知道到底是什么原因，我们用了氯化钙法。和网上找的一种TSB法，都是一样，而且用TSB法的DH5a菌落长的特别的小。 哪位大虾能有好的，实验室已经用了很久的感受态制备protocol能教我一下吗？谢谢啊！ [search]感受态[/search] |
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yufuxian
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2楼2008-01-09 00:01:16
lihuanzheng
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3楼2008-01-09 01:16:53
自己用过，感觉挺好！
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asr(金币+2,VIP+0):thanks.辛苦了!
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Prepare competent cell(1) 1. Pick a single colony of E.coli cells into 4~5 l LB at 37℃ shaking 250 rpm overnight(15~16 h).(or 1:1000, E.coli : LB) for example: 5ul E.coli for 5 ml LB. 2. 100 ml +2ml overnight E.coli culture at 37℃ shaking 2 h.(about OD=0.4) 3. Aliquot separate culure into two 50 ml prechilled sterile polypropylene tubes and leave the tube on ice 5~10 min. centrifuge cells 7 min 3000 rpm, 4℃. 4. Resuspend(gently) each pellet in 10 ml ice-cold 0.1M Cacl2 solution. Centrifuge 5 min at 3400 rpm(1100 g), 4℃. 5. Resuspend each pellet in 10 ml ice-cold 0.1M Cacl2 solution. Keep resuspended cells on ice for 30 min. centrifuge 5 min at 1100 g, 4℃. 6. Resuspend each pellet completely in 4 ml of ice-cold Cacl2 solution, Aliquot 200 ul into prechilled, sterile polypropylene tubes. Freeze immediately at 4℃(last two weeks for using). Or add glycerol at 15% final concentration, freeze immediately at -70℃(last several month for using). For example: 3 ml Cacl2-E.coli with 1 ml 50% glycerol. |
4楼2008-01-09 21:04:23
puma2003
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5楼2008-01-10 17:09:24
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mascotte
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asr(金币+2,VIP+0):thanks.辛苦了!
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我做过很多次感受态细胞了，可以说有一些心得。 基本上过程很简单： 1、从-80冰箱取出菌种，用接种环三区划线涂板，37度培养。 2、从培养了12-16个小时的平板上挑取单菌落，要分散比较好的单克隆，加0.5-1ml LB 37度摇菌6-8小时（也可12-16小时过夜摇）。 3、将小量的菌液转入大500ml三角烧瓶扩增培养。为保证通气良好，500ml三角烧瓶最多摇150ml菌液（100ml足以）。 4、扩增培养时注意将温度设为30度，稍低的温度有利于控制生长状态，不会摇过。 5、培养2小时之后测其OD值，接近0.3以后每20min测一次，在OD值达到0.3以后即可停止培养（可以用水作参比，LB培养基与水的OD值相差无几）。 6、在扩增培养同时制备0.1M CaCl2溶液。（1M CaCl2的母液用0.22um滤膜过滤后作为储存液，用时用灭菌水稀释十倍使用） 7、培养好的菌液立即置于冰上，旋转三角瓶，使其温度迅速冷却到0度。保持旋转状态10min。 8、4000rpm 4度 离心10min，弃去上清，加入0.1M CaCl2溶液。每50ml菌液加入20mlCaCl2溶液，冰上震荡重悬。 9、4000rpm 4度 离心10min，弃去上清，加入0.1M CaCl2溶液。每50ml菌液加入2 mlCaCl2溶液，冰上震荡重悬。 10、加入1/10体积的灭菌甘油。混匀后分装。 要注意的问题： 1、菌种要好，无污染。 2、所用的烧瓶、离心管应在使用前数天用去离子水充分浸泡，去除残留的各种离子。 3、扩增培养摇菌不能摇过。 好的感受态细胞对于分子实验非常重要，请牢记细节决定成败。祝你好运。 |
7楼2008-01-10 19:40:16
mascotte
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skkyy88888
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