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寻找感受态制备的好方法
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最近我们实验室的感受态细胞一直都做的不好，最可怕的就是现做现用还可以 ，但是一放到-70度冰箱再拿出来使用就不行了，连原质粒转化都不长斑。不知道到底是什么原因，我们用了氯化钙法。和网上找的一种TSB法，都是一样，而且用TSB法的DH5a菌落长的特别的小。 哪位大虾能有好的，实验室已经用了很久的感受态制备protocol能教我一下吗？谢谢啊！ [search]感受态[/search] |
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skkyy88888
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yufuxian
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lihuanzheng
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3楼2008-01-09 01:16:53
自己用过，感觉挺好！
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asr(金币+2,VIP+0):thanks.辛苦了!
asr(金币+2,VIP+0):thanks.辛苦了!
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Prepare competent cell(1) 1. Pick a single colony of E.coli cells into 4~5 l LB at 37℃ shaking 250 rpm overnight(15~16 h).(or 1:1000, E.coli : LB) for example: 5ul E.coli for 5 ml LB. 2. 100 ml +2ml overnight E.coli culture at 37℃ shaking 2 h.(about OD=0.4) 3. Aliquot separate culure into two 50 ml prechilled sterile polypropylene tubes and leave the tube on ice 5~10 min. centrifuge cells 7 min 3000 rpm, 4℃. 4. Resuspend(gently) each pellet in 10 ml ice-cold 0.1M Cacl2 solution. Centrifuge 5 min at 3400 rpm(1100 g), 4℃. 5. Resuspend each pellet in 10 ml ice-cold 0.1M Cacl2 solution. Keep resuspended cells on ice for 30 min. centrifuge 5 min at 1100 g, 4℃. 6. Resuspend each pellet completely in 4 ml of ice-cold Cacl2 solution, Aliquot 200 ul into prechilled, sterile polypropylene tubes. Freeze immediately at 4℃(last two weeks for using). Or add glycerol at 15% final concentration, freeze immediately at -70℃(last several month for using). For example: 3 ml Cacl2-E.coli with 1 ml 50% glycerol. |
4楼2008-01-09 21:04:23
