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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 生物科学 » 镍柱纯化His标签蛋白，洗脱不下来
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海之韵-哈哈

银虫 (小有名气)

[求助] 镍柱纯化His标签蛋白，洗脱不下来 已有4人参与

镍柱纯化带有组氨酸标签的蛋白，用了各种浓度的咪唑进行洗脱还是洗脱不下来，蛋白还是挂在柱子上，怎么办啊，感觉看不到希望了，希望大家帮我分析一下，发不了文章就毕不了业啦。好郁闷啊                                                                                                     由于蛋白表达量少所以选择将酶液多次上柱，洗脱液是由50mM pH7.5的PBS配制，氯化钠浓度为400mM                                                                         1:10mM咪唑洗脱；2:15mM咪唑洗脱；3:20mM咪唑洗脱；4:50mM咪唑洗脱；5:500微升200mM咪唑洗脱；6:1毫升500mM咪唑洗脱；7:1毫升1000mM咪唑洗脱；8:最后离心剩下的resin；从第8泳道可以看出大部分蛋白还是挂在柱子上的。纯化后要得到有活性的蛋白，计算回收率。如果在升高咪唑浓度怕高浓度咪唑会影响到酶的活性。但是现在的回收率太低了，怎样才能提高纯化效率啊？
镍柱纯化His标签蛋白，洗脱不下来
图片1.jpg
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严以律已，宽以待人
1楼 2014-01-03 16:17:06
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caas2006

木虫 (正式写手)
引用回帖:
9楼: Originally posted by 海之韵-哈哈 at 2014-01-05 13:52:41
只有N端有组氨酸标签，蛋白的PI大约是6左右。pH7.5的缓冲液中加入咪唑后pH值确实会增大，如何避免这种情况啊？在纯化过程中蛋白为什么会变性沉淀啊？请多指教...

缓冲液应该加了咪唑后调pH的
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11楼2014-01-08 10:43:34
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caas2006

木虫 (正式写手)
★ ★
silicare: 金币+2, 谢谢参与 2014-01-07 17:36:18
是不是洗脱缓冲液的pH太高了哦
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2楼2014-01-03 17:24:02
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caas2006

木虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

★ ★ ★ ★ ★
silicare: 金币+5, BioEPI+1, 应助指数+1, 谢谢参与 2014-01-07 17:36:31
1. 如果N-和C-同时带有组氨酸标签，会使洗脱的咪唑浓度增加
2.蛋白本身的PI过高也会增加洗脱难度
3.洗脱缓冲液的pH过高
4.纯化过程中蛋白变性沉淀
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3楼2014-01-03 17:29:13
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克隆大虾

铁杆木虫 (著名写手)

【答案】应助回帖

★
感谢参与，应助指数 +1
silicare: 金币+1, 可能 2014-01-07 17:36:48
也有可能是咪唑有问题。新手还是以前纯化过蛋白？
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4楼2014-01-03 17:46:14
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