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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » 综合其他 » 纯化克隆
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trizol11

木虫 (正式写手)

[求助] 纯化克隆 已有1人参与

尊敬的各位虫友：
     我现在遇到一个问题，缠绕我很久了。你们有没遇到PCR产物回收后浓度很低，无法达到克隆所需的浓度。
我刚测的回收产物1：260/280比值是3、 浓度是0.15微克每微升.2:260/280比值是1.66、浓度0.25维克每微升。

求大神指点！
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任重道远……
1楼 2014-01-02 15:06:06
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trizol11

木虫 (正式写手)
引用回帖:
2楼: Originally posted by cicelyzh at 2014-01-03 00:17:16
这浓度不错呀，通常回收的浓度在几百ng/μl，做克隆只需要1微克DNA吧，你回收的产物难道没有五六微升？

你看到的我发出来的浓度是稀释50倍的结果，我再乘以50，那么1微升就是至少6微克，我用这个体系：1 载体、4 目的片段、5 BUFFER，不加水了，你觉得可以么？
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任重道远……
4楼2014-01-03 11:31:00
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cicelyzh

铁杆木虫 (职业作家)

【答案】应助回帖

★ ★ ★ ★ ★ ★ ★
感谢参与，应助指数 +1
trizol11(kx444555代发): 金币+2, 鼓励交流 2014-01-03 09:44:48
trizol11: 金币+5 2014-01-03 11:31:35
这浓度不错呀，通常回收的浓度在几百ng/μl，做克隆只需要1微克DNA吧，你回收的产物难道没有五六微升？
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2楼2014-01-03 00:17:16
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trizol11

木虫 (正式写手)
引用回帖:
2楼: Originally posted by cicelyzh at 2014-01-03 00:17:16
这浓度不错呀，通常回收的浓度在几百ng/μl，做克隆只需要1微克DNA吧，你回收的产物难道没有五六微升？

我做实验未能及时回复，请见谅。但是我的载体1微升是40NG，克隆的时候就是不长菌。我很苦恼……，谢谢你的帮组。
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任重道远……
3楼2014-01-03 11:21:45
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cicelyzh

铁杆木虫 (职业作家)

【答案】应助回帖

★ ★ ★
trizol11: 金币+3, ★★★很有帮助 2014-01-03 21:45:20
引用回帖:
4楼: Originally posted by trizol11 at 2014-01-03 11:31:00
你看到的我发出来的浓度是稀释50倍的结果，我再乘以50，那么1微升就是至少6微克，我用这个体系：1 载体、4 目的片段、5 BUFFER，不加水了，你觉得可以么？...

做连接的话，在10-20μl体系里加入载体50ng，目的片段根据大小计算ng数，目的片段与载体的摩尔比为3:1。如果目的片段非常小，可以用到10:1。如果不长菌，通常是酶切的问题。
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5楼2014-01-03 16:08:54
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