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destinygazer

新虫 (初入文坛)

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[交流] 求助，绝对定量PCR低浓度的标准品ct值几乎一致是什么原因？已有3人参与

绝对定量的实验中，为什么我低浓度的几个的CT值都差不多啊？稀释倍数是10的6次方到10的0次方。可是从10的2次方开始，几个标准品的ct值都几乎在一样的25,26。请问这是什么原因呢？
用的是ABI7300的机器。

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1楼 2013-12-31 15:23:03

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cicelyzh

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引用回帖:

3楼: Originally posted by destinygazer at 2014-01-03 11:33:49
可是我师兄也是这样做的，他用的是7500，可能试剂不一样，但是他都有结果的。是不是试剂的问题导致扩增不正常呢？...

一般不会。比较有信誉的大公司的试剂是有保证的。如果你怀疑试剂的问题，为什么不用与师兄相同的试剂做？
看你的扩增曲线就知道，有些反应不正常。扩增你的目的基因时用浓度最高的CT值是16，如果再稀释10^6（最稀的样品），CT的理论值是36。CT值高于35基本上是不可信的数据了。何况这是在扩增效率为100%的理想情况，低浓度的模板的扩增效率会下降。如果你非要10倍稀释模板，通常的标准曲线上只能有4个点。用5倍稀释可以比较理想的满足CT在15-30之间取5-6个点。