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destinygazer

新虫 (初入文坛)

[交流] 求助，绝对定量PCR低浓度的标准品ct值几乎一致是什么原因？ 已有3人参与

绝对定量的实验中，为什么我低浓度的几个的CT值都差不多啊？稀释倍数是10的6次方到10的0次方。可是从10的2次方开始，几个标准品的ct值都几乎在一样的25,26。请问这是什么原因呢？
用的是ABI7300的机器。
求助，绝对定量PCR低浓度的标准品ct值几乎一致是什么原因？
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1楼 2013-12-31 15:23:03
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cicelyzh

铁杆木虫 (职业作家)
★ ★ ★
小木虫: 金币+0.5, 给个红包，谢谢回帖
gyesang: 金币+2, 鼓励交流！ 2014-01-01 00:48:23
模板浓度太小，扩增不正常。一般做标准曲线5倍稀释就可以了，CT值最好在15-30之间。
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2楼2014-01-01 00:25:39
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destinygazer

新虫 (初入文坛)
引用回帖:
2楼: Originally posted by cicelyzh at 2014-01-01 00:25:39
模板浓度太小，扩增不正常。一般做标准曲线5倍稀释就可以了，CT值最好在15-30之间。

可是我师兄也是这样做的，他用的是7500，可能试剂不一样，但是他都有结果的。是不是试剂的问题导致扩增不正常呢？
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3楼2014-01-03 11:33:49
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意萧02

木虫 (正式写手)
谢谢楼主分享！！！
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4楼2014-01-03 14:55:27
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bullfrog325

木虫 (正式写手)
★
小木虫: 金币+0.5, 给个红包，谢谢回帖
一种可能是有底浓度的模板污染， 另一种可能是引物不好容易形成二具体
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5楼2014-01-03 22:59:17
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cicelyzh

铁杆木虫 (职业作家)
★
小木虫: 金币+0.5, 给个红包，谢谢回帖
引用回帖:
3楼: Originally posted by destinygazer at 2014-01-03 11:33:49
可是我师兄也是这样做的，他用的是7500，可能试剂不一样，但是他都有结果的。是不是试剂的问题导致扩增不正常呢？...

一般不会。比较有信誉的大公司的试剂是有保证的。如果你怀疑试剂的问题，为什么不用与师兄相同的试剂做？
看你的扩增曲线就知道，有些反应不正常。扩增你的目的基因时用浓度最高的CT值是16，如果再稀释10^6（最稀的样品），CT的理论值是36。CT值高于35基本上是不可信的数据了。何况这是在扩增效率为100%的理想情况，低浓度的模板的扩增效率会下降。如果你非要10倍稀释模板，通常的标准曲线上只能有4个点。用5倍稀释可以比较理想的满足CT在15-30之间取5-6个点。
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6楼2014-01-04 03:43:19
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