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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » 综合其他 » 求助overlap技术
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yanjinyuan

银虫 (小有名气)

[求助] 求助overlap技术 已有2人参与

大家帮忙分析一下，我要overlap，启动子区直接从基因组扩增约4k，而编码区从cDNA上好不容易扩增约1k, 回收后条带都很单一而较亮，但是overlap以后，完全没有条带，试过touchdown,也不行。大家帮忙看看
求助overlap技术
12.24  ser4 overlap_副本.jpg
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加油，早点毕业
1楼 2013-12-25 22:45:45
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lvbobo823

铁杆木虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

★
感谢参与，应助指数 +1
myprayer: 金币+1, 赠人玫瑰手有余香，分子生物期待你更多精彩。 2013-12-26 13:04:47
你扩增的片段有些大，做overlap我们一般都不超过3kb。你所需启动子比基因区域大建议你让这两个片段的重叠区域大一些，另外调整好这两个片段的浓度，一般不要太大稀释上10倍左右1:1混合。扩这大片段选用一些好点的酶扩增。若不行建议加个酶切位点吧。毕竟片段有点大。
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hehe
2楼2013-12-26 11:41:33
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yanjinyuan

银虫 (小有名气)
引用回帖:
2楼: Originally posted by lvbobo823 at 2013-12-26 11:41:33
你扩增的片段有些大，做overlap我们一般都不超过3kb。你所需启动子比基因区域大建议你让这两个片段的重叠区域大一些，另外调整好这两个片段的浓度，一般不要太大稀释上10倍左右1:1混合。扩这大片段选用一些好点的酶 ...

我设置的是这样的
启动子
1上游     CGGGATCCCGTTCCCCCCCTCTGACGACTACT
2下游     AGAAGCGTCTCGTCGATCAT ctggacaaaaaaagtgattt

编码区

3上游引物  aaatcactttttttgtccagATGATCGACGAGACGCTTCT
4下游引物  GGGGTACCCCTCAATAATCGTGAATAAGGC
还有做overlap的两个模板要稀释吗？
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加油，早点毕业
3楼2013-12-26 12:19:18
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王者归来001

木虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

★ ★
感谢参与，应助指数 +1
gyesang: 金币+2, 鼓励交流！ 2013-12-26 14:57:04
换一换酶看看，我们实验室之前也做OVER-LAP，换了全式金的酶后很容易的连上了，约3K大小的
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坚持不懈,终会成功!
4楼2013-12-26 13:41:13
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yanjinyuan

银虫 (小有名气)
引用回帖:
4楼: Originally posted by 王者归来001 at 2013-12-26 13:41:13
换一换酶看看，我们实验室之前也做OVER-LAP，换了全式金的酶后很容易的连上了，约3K大小的

我现在用的就是全式金的Hifi酶
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加油，早点毕业
5楼2013-12-26 14:13:36
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lvbobo823

铁杆木虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

★ ★ ★ ★ ★ ★ ★
yanjinyuan: 金币+5, 先谢谢了，我先做了试试，不行再请教啊 2013-12-27 11:28:32
gyesang: 金币+2, 鼓励交流！ 2013-12-30 14:47:43
gyesang: 回帖置顶 2013-12-30 14:47:51
我实验室之前也有人做overlap模板没稀释扩不出来，稀释了一下就扩出来了。你的重合碱基就20bp有点少啊，建议加到30bp以上。合成引物时在找几个合适的酶切位点也合成些引物，防止overlap不工作耽误时间，先连载体再酶切连接下一片段。
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hehe
6楼2013-12-27 07:55:39
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yanjinyuan

银虫 (小有名气)
引用回帖:
6楼: Originally posted by lvbobo823 at 2013-12-27 07:55:39
我实验室之前也有人做overlap模板没稀释扩不出来，稀释了一下就扩出来了。你的重合碱基就20bp有点少啊，建议加到30bp以上。合成引物时在找几个合适的酶切位点也合成些引物，防止overlap不工作耽误时间，先连载体再酶 ...

分别稀释了10倍和100倍做了，也还是弥散的条带，而且换了TAKARA的LA酶也是弥散的，唉！还有可能是什么问题？
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加油，早点毕业
7楼2013-12-30 14:25:32
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lvbobo823

铁杆木虫 (正式写手)
你片段有点太大了，还是加酶切位点，一步步慢慢做吧，overlap虽然快但不容易做出来。
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hehe
8楼2013-12-31 09:11:41
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