应《网络安全法》要求，自2017年10月1日起，未进行实名认证将不得使用互联网跟帖服务。为保障您的帐号能够正常使用，请尽快对帐号进行手机号验证，感谢您的理解与支持！

24小时热门版块排行榜    

小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » 综合其他 » 求助overlap技术
北京石油化工学院2026年研究生招生接收调剂公告
81/1返回列表
查看: 1924  |  回复: 7
只看楼主 @他人 存档 新回复提醒 (忽略) 收藏    在APP中查看

yanjinyuan

银虫 (小有名气)

[求助] 求助overlap技术 已有2人参与

大家帮忙分析一下，我要overlap，启动子区直接从基因组扩增约4k，而编码区从cDNA上好不容易扩增约1k, 回收后条带都很单一而较亮，但是overlap以后，完全没有条带，试过touchdown,也不行。大家帮忙看看
求助overlap技术
12.24  ser4 overlap_副本.jpg
回复此楼

» 猜你喜欢

» 本主题相关价值贴推荐，对您同样有帮助:
加油，早点毕业
1楼 2013-12-25 22:45:45
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖
回帖置顶 ( 共有1个 )

lvbobo823

铁杆木虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

★ ★ ★ ★ ★ ★ ★
yanjinyuan: 金币+5, 先谢谢了，我先做了试试，不行再请教啊 2013-12-27 11:28:32
gyesang: 金币+2, 鼓励交流！ 2013-12-30 14:47:43
gyesang: 回帖置顶 2013-12-30 14:47:51
我实验室之前也有人做overlap模板没稀释扩不出来，稀释了一下就扩出来了。你的重合碱基就20bp有点少啊，建议加到30bp以上。合成引物时在找几个合适的酶切位点也合成些引物，防止overlap不工作耽误时间，先连载体再酶切连接下一片段。
赞一下 回复此楼
hehe
6楼2013-12-27 07:55:39
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖
普通回帖

lvbobo823

铁杆木虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

★
感谢参与，应助指数 +1
myprayer: 金币+1, 赠人玫瑰手有余香，分子生物期待你更多精彩。 2013-12-26 13:04:47
你扩增的片段有些大，做overlap我们一般都不超过3kb。你所需启动子比基因区域大建议你让这两个片段的重叠区域大一些，另外调整好这两个片段的浓度，一般不要太大稀释上10倍左右1:1混合。扩这大片段选用一些好点的酶扩增。若不行建议加个酶切位点吧。毕竟片段有点大。
赞一下 回复此楼
hehe
2楼2013-12-26 11:41:33
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

yanjinyuan

银虫 (小有名气)
引用回帖:
2楼: Originally posted by lvbobo823 at 2013-12-26 11:41:33
你扩增的片段有些大，做overlap我们一般都不超过3kb。你所需启动子比基因区域大建议你让这两个片段的重叠区域大一些，另外调整好这两个片段的浓度，一般不要太大稀释上10倍左右1:1混合。扩这大片段选用一些好点的酶 ...

我设置的是这样的
启动子
1上游     CGGGATCCCGTTCCCCCCCTCTGACGACTACT
2下游     AGAAGCGTCTCGTCGATCAT ctggacaaaaaaagtgattt

编码区

3上游引物  aaatcactttttttgtccagATGATCGACGAGACGCTTCT
4下游引物  GGGGTACCCCTCAATAATCGTGAATAAGGC
还有做overlap的两个模板要稀释吗？
赞一下 回复此楼
加油，早点毕业
3楼2013-12-26 12:19:18
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

王者归来001

木虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

★ ★
感谢参与，应助指数 +1
gyesang: 金币+2, 鼓励交流！ 2013-12-26 14:57:04
换一换酶看看，我们实验室之前也做OVER-LAP，换了全式金的酶后很容易的连上了，约3K大小的
赞一下(1人) 回复此楼
坚持不懈,终会成功!
4楼2013-12-26 13:41:13
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

yanjinyuan

银虫 (小有名气)
引用回帖:
4楼: Originally posted by 王者归来001 at 2013-12-26 13:41:13
换一换酶看看，我们实验室之前也做OVER-LAP，换了全式金的酶后很容易的连上了，约3K大小的

我现在用的就是全式金的Hifi酶
赞一下 回复此楼
加油，早点毕业
5楼2013-12-26 14:13:36
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

yanjinyuan

银虫 (小有名气)
引用回帖:
6楼: Originally posted by lvbobo823 at 2013-12-27 07:55:39
我实验室之前也有人做overlap模板没稀释扩不出来，稀释了一下就扩出来了。你的重合碱基就20bp有点少啊，建议加到30bp以上。合成引物时在找几个合适的酶切位点也合成些引物，防止overlap不工作耽误时间，先连载体再酶 ...

分别稀释了10倍和100倍做了，也还是弥散的条带，而且换了TAKARA的LA酶也是弥散的，唉！还有可能是什么问题？
赞一下 回复此楼
加油，早点毕业
7楼2013-12-30 14:25:32
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

lvbobo823

铁杆木虫 (正式写手)
你片段有点太大了，还是加酶切位点，一步步慢慢做吧，overlap虽然快但不容易做出来。
赞一下 回复此楼
hehe
8楼2013-12-31 09:11:41
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖
相关版块跳转 我要订阅楼主 yanjinyuan 的主题更新
81/1返回列表
普通表情 龙 兔 虎 猫
最具人气热帖推荐 [查看全部] 作者 回/看 最后发表
[考研] 求调剂 +5 熊二想上岸 2026-04-04 5/250 2026-04-04 20:13 by wxiongid
[考研] 求生物学调剂 +14 15172915737 2026-04-01 14/700 2026-04-04 20:13 by babysonlkd
[考研] 化学调剂 +12 艾志恒 2026-04-03 13/650 2026-04-04 20:11 by xhai2011
[考研] 求调剂 +6 xzghyuj 2026-04-04 6/300 2026-04-04 20:09 by dongzh2009
[考研] 材料工程310专硕调剂 +5 捞捞我…. 2026-04-04 5/250 2026-04-04 19:42 by 唐沐儿
[考研] 350一志愿北京航空航天大学08500材料科学与工程求调剂 +5 kjnasfss 2026-04-03 5/250 2026-04-03 22:29 by 无际的草原
[考研] 311求调剂 +11 勇敢的小吴 2026-04-02 11/550 2026-04-03 21:46 by qlm5820
[考研] 材料专硕调剂 +18 椰椰。 2026-03-29 18/900 2026-04-03 16:45 by 玲玲0606
[考研] 机械专硕297 +3 Afksy 2026-04-03 3/150 2026-04-03 14:24 by 1753564080
[考研] 279求调剂 +6 qazplm0852 2026-04-02 6/300 2026-04-03 10:03 by 蓝云思雨
[考研] 一志愿陕西师范大学生物学317分 +5 1563日。 2026-04-02 5/250 2026-04-03 06:58 by ilovexiaobin
[考研] 085600调剂 +3 1amJJ 2026-04-02 3/150 2026-04-02 22:00 by 科研小专家
[考研] 求调剂 302分初试 0854 +5 伶可乐 2026-04-02 5/250 2026-04-02 17:53 by 笔落锦州
[考研] 322求调剂 +5 熹僖XX 2026-03-31 6/300 2026-04-02 10:08 by 求调剂zz
[考研] 一志愿 南京航空航天大学 ，080500材料科学与工程学硕 +7 @taotao 2026-03-30 7/350 2026-04-01 14:30 by chenqifeng666
[考研] 求调剂：一志愿：南京大学 专业：0705 总分320 ，本科985，四六级已过 +3 lfy760306 2026-03-31 3/150 2026-04-01 01:57 by Creta
[考研] 375求调剂 +7 雨夏整夜 2026-03-29 7/350 2026-03-31 18:52 by xhai2011
[考研] 求调剂 生物学 377分 +6 zzll03 2026-03-31 6/300 2026-03-31 17:33 by 唐沐儿
[考研] 吉大生物学326分求调剂 +3 sunnyupup 2026-03-31 3/150 2026-03-31 09:28 by longlotian
[考研] 296求调剂 +10 彼岸t 2026-03-29 10/500 2026-03-30 10:50 by 探123
信息提示
关闭
请填处理意见
关闭