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wsliuqiulei

铜虫 (初入文坛)

[求助] qPCR求助 已有2人参与

1.扩增曲线的R平方多在90%-95%，请问怎么解决？
2.基因丰度比较低，未经稀释的cDNA模板的ct几乎就在23-26了，请问高手们怎么进行下一步的不同处理间的比较啊？
3.几个基因的扩增效率在100%-105%之间，但是R平方在95%-99%之间，并没有在99%之上，请问这样的扩增效率是否可用？
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1楼 2013-12-15 23:17:46
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min8717

银虫 (初入文坛)

【答案】应助回帖

R2只有90到95，线性不好啊！是肯定不行的，至少也要达到两个9以上，既然线性不好了，还谈扩增效率是没什么意义的，要知道扩增效率就是根据斜率计算的来。建议你先测测你的cDNA浓度有多少，我觉得是你的浓度太大了，已经起到抑制扩增了。
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天助自助者
8楼2014-01-08 10:59:24
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cicelyzh

铁杆木虫 (职业作家)

【答案】应助回帖

★
感谢参与，应助指数 +1
myprayer: 金币+1, 赠人玫瑰手有余香，分子生物期待你更多精彩。 2013-12-17 12:37:59
1. 大于90%已经算是不错的，可能退火温度不是最优，稍微降低一点点试试。
2. 用2倍梯度稀释或者在逆转录时增加RNA的用量。
3. 可以。R^2不够好可能是操作或者其他因素。扩增效率好说明扩增反应的CT与产物浓度有良好的2倍关系，可以用于定量。
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2楼2013-12-16 01:42:24
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wsliuqiulei

铜虫 (初入文坛)
引用回帖:
2楼: Originally posted by cicelyzh at 2013-12-16 01:42:24
1. 大于90%已经算是不错的，可能退火温度不是最优，稍微降低一点点试试。
2. 用2倍梯度稀释或者在逆转录时增加RNA的用量。
3. 可以。R^2不够好可能是操作或者其他因素。扩增效率好说明扩增反应的CT与产物浓度有良 ...

多谢cicelyzh
还想追加问一下：
1.梯度PCR显示一个基因的一对引物有4个退火温度都是单一的目的条带，你的意思是这4个退火温度在上机时可能会有差异导致R^2在90%-95%吗？
2.逆转录时增加RNA的量与通常情况下加大cDNA的量上机是一样道理吧？
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3楼2013-12-17 11:14:52
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cicelyzh

铁杆木虫 (职业作家)
★ ★
gyesang: 金币+2, 鼓励交流！ 2013-12-24 23:32:05
引用回帖:
3楼: Originally posted by wsliuqiulei at 2013-12-17 11:14:52
多谢cicelyzh
还想追加问一下：
1.梯度PCR显示一个基因的一对引物有4个退火温度都是单一的目的条带，你的意思是这4个退火温度在上机时可能会有差异导致R^2在90%-95%吗？
2.逆转录时增加RNA的量与通常情况下加大 ...

1. 看扩增效率，一般是随着退火温度提高扩增效率可能下降，在扩增效率符合要求的前提下尽量用温度最高。但有时候为了和其它基因一起做，需要选择较低的退火温度。
2. 目的是相同的。但cDNA的体积在qPCR体系里不能太高，否则逆转录体系里的一些物质会干扰定量。
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4楼2013-12-17 12:55:28
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