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wsliuqiulei

铜虫 (初入文坛)

[求助] qPCR求助 已有2人参与

1.扩增曲线的R平方多在90%-95%，请问怎么解决？
2.基因丰度比较低，未经稀释的cDNA模板的ct几乎就在23-26了，请问高手们怎么进行下一步的不同处理间的比较啊？
3.几个基因的扩增效率在100%-105%之间，但是R平方在95%-99%之间，并没有在99%之上，请问这样的扩增效率是否可用？
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1楼 2013-12-15 23:17:46
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cicelyzh

铁杆木虫 (职业作家)

【答案】应助回帖

★
感谢参与，应助指数 +1
myprayer: 金币+1, 赠人玫瑰手有余香，分子生物期待你更多精彩。 2013-12-17 12:37:59
1. 大于90%已经算是不错的，可能退火温度不是最优，稍微降低一点点试试。
2. 用2倍梯度稀释或者在逆转录时增加RNA的用量。
3. 可以。R^2不够好可能是操作或者其他因素。扩增效率好说明扩增反应的CT与产物浓度有良好的2倍关系，可以用于定量。
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2楼2013-12-16 01:42:24
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wsliuqiulei

铜虫 (初入文坛)
引用回帖:
2楼: Originally posted by cicelyzh at 2013-12-16 01:42:24
1. 大于90%已经算是不错的，可能退火温度不是最优，稍微降低一点点试试。
2. 用2倍梯度稀释或者在逆转录时增加RNA的用量。
3. 可以。R^2不够好可能是操作或者其他因素。扩增效率好说明扩增反应的CT与产物浓度有良 ...

多谢cicelyzh
还想追加问一下：
1.梯度PCR显示一个基因的一对引物有4个退火温度都是单一的目的条带，你的意思是这4个退火温度在上机时可能会有差异导致R^2在90%-95%吗？
2.逆转录时增加RNA的量与通常情况下加大cDNA的量上机是一样道理吧？
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3楼2013-12-17 11:14:52
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cicelyzh

铁杆木虫 (职业作家)
★ ★
gyesang: 金币+2, 鼓励交流！ 2013-12-24 23:32:05
引用回帖:
3楼: Originally posted by wsliuqiulei at 2013-12-17 11:14:52
多谢cicelyzh
还想追加问一下：
1.梯度PCR显示一个基因的一对引物有4个退火温度都是单一的目的条带，你的意思是这4个退火温度在上机时可能会有差异导致R^2在90%-95%吗？
2.逆转录时增加RNA的量与通常情况下加大 ...

1. 看扩增效率，一般是随着退火温度提高扩增效率可能下降，在扩增效率符合要求的前提下尽量用温度最高。但有时候为了和其它基因一起做，需要选择较低的退火温度。
2. 目的是相同的。但cDNA的体积在qPCR体系里不能太高，否则逆转录体系里的一些物质会干扰定量。
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4楼2013-12-17 12:55:28
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wsliuqiulei

铜虫 (初入文坛)
引用回帖:
4楼: Originally posted by cicelyzh at 2013-12-17 12:55:28
1. 看扩增效率，一般是随着退火温度提高扩增效率可能下降，在扩增效率符合要求的前提下尽量用温度最高。但有时候为了和其它基因一起做，需要选择较低的退火温度。
2. 目的是相同的。但cDNA的体积在qPCR体系里不能 ...

非常感谢指导，受益匪浅！积极向你学习中
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5楼2013-12-18 09:46:31
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wsliuqiulei

铜虫 (初入文坛)
引用回帖:
4楼: Originally posted by cicelyzh at 2013-12-17 12:55:28
1. 看扩增效率，一般是随着退火温度提高扩增效率可能下降，在扩增效率符合要求的前提下尽量用温度最高。但有时候为了和其它基因一起做，需要选择较低的退火温度。
2. 目的是相同的。但cDNA的体积在qPCR体系里不能 ...

你好，再向你请教请教吧，有两个问题：
1.qPCR的校正器样本有什么作用？请不要在字面上解释，谢谢啦！

2.一个反应板上两个需要比较的样品，待检测基因，分别对样品都设置了内参反应，数据跑出来了，请问高手们后续的我改怎么去分析比较待检测基因在两个样品间的表达差异啊？越详细越好
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6楼2013-12-24 21:32:00
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cicelyzh

铁杆木虫 (职业作家)
引用回帖:
6楼: Originally posted by wsliuqiulei at 2013-12-24 21:32:00
你好，再向你请教请教吧，有两个问题：
1.qPCR的校正器样本有什么作用？请不要在字面上解释，谢谢啦！

2.一个反应板上两个需要比较的样品，待检测基因，分别对样品都设置了内参反应，数据跑出来了，请问高手们 ...

1. 不知道什么胶矫正器样本。没有用过。
2. 表达量用公式2^(-ΔΔCt)计算。
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7楼2013-12-25 06:45:15
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min8717

银虫 (初入文坛)

【答案】应助回帖

R2只有90到95，线性不好啊！是肯定不行的，至少也要达到两个9以上，既然线性不好了，还谈扩增效率是没什么意义的，要知道扩增效率就是根据斜率计算的来。建议你先测测你的cDNA浓度有多少，我觉得是你的浓度太大了，已经起到抑制扩增了。
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天助自助者
8楼2014-01-08 10:59:24
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