应《网络安全法》要求，自2017年10月1日起，未进行实名认证将不得使用互联网跟帖服务。为保障您的帐号能够正常使用，请尽快对帐号进行手机号验证，感谢您的理解与支持！

24小时热门版块排行榜    

小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » 综合其他 » qPCR求助
81/1返回列表
查看: 1073  |  回复: 7
只看楼主 @他人 存档 新回复提醒 (忽略) 收藏    在APP中查看

wsliuqiulei

铜虫 (初入文坛)

[求助] qPCR求助 已有2人参与

1.扩增曲线的R平方多在90%-95%，请问怎么解决？
2.基因丰度比较低，未经稀释的cDNA模板的ct几乎就在23-26了，请问高手们怎么进行下一步的不同处理间的比较啊？
3.几个基因的扩增效率在100%-105%之间，但是R平方在95%-99%之间，并没有在99%之上，请问这样的扩增效率是否可用？
回复此楼

» 猜你喜欢
1楼 2013-12-15 23:17:46
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

cicelyzh

铁杆木虫 (职业作家)

【答案】应助回帖

★
感谢参与，应助指数 +1
myprayer: 金币+1, 赠人玫瑰手有余香，分子生物期待你更多精彩。 2013-12-17 12:37:59
1. 大于90%已经算是不错的，可能退火温度不是最优，稍微降低一点点试试。
2. 用2倍梯度稀释或者在逆转录时增加RNA的用量。
3. 可以。R^2不够好可能是操作或者其他因素。扩增效率好说明扩增反应的CT与产物浓度有良好的2倍关系，可以用于定量。
赞一下 回复此楼
2楼2013-12-16 01:42:24
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

wsliuqiulei

铜虫 (初入文坛)
引用回帖:
2楼: Originally posted by cicelyzh at 2013-12-16 01:42:24
1. 大于90%已经算是不错的，可能退火温度不是最优，稍微降低一点点试试。
2. 用2倍梯度稀释或者在逆转录时增加RNA的用量。
3. 可以。R^2不够好可能是操作或者其他因素。扩增效率好说明扩增反应的CT与产物浓度有良 ...

多谢cicelyzh
还想追加问一下：
1.梯度PCR显示一个基因的一对引物有4个退火温度都是单一的目的条带，你的意思是这4个退火温度在上机时可能会有差异导致R^2在90%-95%吗？
2.逆转录时增加RNA的量与通常情况下加大cDNA的量上机是一样道理吧？
赞一下 回复此楼
3楼2013-12-17 11:14:52
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

cicelyzh

铁杆木虫 (职业作家)
★ ★
gyesang: 金币+2, 鼓励交流！ 2013-12-24 23:32:05
引用回帖:
3楼: Originally posted by wsliuqiulei at 2013-12-17 11:14:52
多谢cicelyzh
还想追加问一下：
1.梯度PCR显示一个基因的一对引物有4个退火温度都是单一的目的条带，你的意思是这4个退火温度在上机时可能会有差异导致R^2在90%-95%吗？
2.逆转录时增加RNA的量与通常情况下加大 ...

1. 看扩增效率，一般是随着退火温度提高扩增效率可能下降，在扩增效率符合要求的前提下尽量用温度最高。但有时候为了和其它基因一起做，需要选择较低的退火温度。
2. 目的是相同的。但cDNA的体积在qPCR体系里不能太高，否则逆转录体系里的一些物质会干扰定量。
赞一下 回复此楼
4楼2013-12-17 12:55:28
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

wsliuqiulei

铜虫 (初入文坛)
引用回帖:
4楼: Originally posted by cicelyzh at 2013-12-17 12:55:28
1. 看扩增效率，一般是随着退火温度提高扩增效率可能下降，在扩增效率符合要求的前提下尽量用温度最高。但有时候为了和其它基因一起做，需要选择较低的退火温度。
2. 目的是相同的。但cDNA的体积在qPCR体系里不能 ...

非常感谢指导，受益匪浅！积极向你学习中
赞一下 回复此楼
5楼2013-12-18 09:46:31
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

wsliuqiulei

铜虫 (初入文坛)
引用回帖:
4楼: Originally posted by cicelyzh at 2013-12-17 12:55:28
1. 看扩增效率，一般是随着退火温度提高扩增效率可能下降，在扩增效率符合要求的前提下尽量用温度最高。但有时候为了和其它基因一起做，需要选择较低的退火温度。
2. 目的是相同的。但cDNA的体积在qPCR体系里不能 ...

你好，再向你请教请教吧，有两个问题：
1.qPCR的校正器样本有什么作用？请不要在字面上解释，谢谢啦！

2.一个反应板上两个需要比较的样品，待检测基因，分别对样品都设置了内参反应，数据跑出来了，请问高手们后续的我改怎么去分析比较待检测基因在两个样品间的表达差异啊？越详细越好
赞一下 回复此楼
6楼2013-12-24 21:32:00
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

cicelyzh

铁杆木虫 (职业作家)
引用回帖:
6楼: Originally posted by wsliuqiulei at 2013-12-24 21:32:00
你好，再向你请教请教吧，有两个问题：
1.qPCR的校正器样本有什么作用？请不要在字面上解释，谢谢啦！

2.一个反应板上两个需要比较的样品，待检测基因，分别对样品都设置了内参反应，数据跑出来了，请问高手们 ...

1. 不知道什么胶矫正器样本。没有用过。
2. 表达量用公式2^(-ΔΔCt)计算。
赞一下 回复此楼
7楼2013-12-25 06:45:15
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

min8717

银虫 (初入文坛)

【答案】应助回帖

R2只有90到95，线性不好啊！是肯定不行的，至少也要达到两个9以上，既然线性不好了，还谈扩增效率是没什么意义的，要知道扩增效率就是根据斜率计算的来。建议你先测测你的cDNA浓度有多少，我觉得是你的浓度太大了，已经起到抑制扩增了。
赞一下 回复此楼
天助自助者
8楼2014-01-08 10:59:24
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖
相关版块跳转 我要订阅楼主 wsliuqiulei 的主题更新
81/1返回列表
普通表情 龙 兔 虎 猫
最具人气热帖推荐 [查看全部] 作者 回/看 最后发表
[考博] 售SCI一区T0P文章，我:8.O.55.1.O54,科目全,可伽急 +4 ASdOkHsho7FD 2026-08-28 7/350 2026-08-29 14:15 by jCd0dEvKHShX
[论文投稿] 售SCI一区文章，我:8.O.551.O.5.4,科目全,可伽急 +3 ASdOkHsho7FD 2026-08-28 4/200 2026-08-29 14:13 by jCd0dEvKHShX
[基金申请] 麻烦专家们看看评委们的意见（F口面上） +5 gdd2018 2026-08-28 10/500 2026-08-29 14:10 by Jacob678
[公派出国] 售SCI一区T0P文章，我:8.O.55.1.O.5.4,科目全,可+急 +3 ASdOkHsho7FD 2026-08-28 4/200 2026-08-29 14:02 by jCd0dEvKHShX
[教师之家] 售SCI一区T0P文章，我:8.O.55.1.O54,科目全,可伽急 +4 ASdOkHsho7FD 2026-08-28 5/250 2026-08-29 11:49 by jCd0dEvKHShX
[考研] 售SCI一区文章，我:8.O.55.1.O.54,科目齐全,可伽急 +6 ASdOkHsho7FD 2026-08-28 9/450 2026-08-29 11:18 by jCd0dEvKHShX
[基金申请] 我就是申请一个面上项目而已，这评审意见是按照杰青的条件评的吧？ +6 gouxfjh 2026-08-28 9/450 2026-08-29 09:59 by jklily
[教师之家] 售SCI-T0P文章，我:8O.5.5.1.O.54,科目齐全,可+急 +4 ASdOkHsho7FD 2026-08-28 7/350 2026-08-29 09:26 by G6APbkg8SA6w
[基金申请] 为什么资助数各大高校都创新高，自己申请怎么就这么难 +12 Kittylucky 2026-08-27 13/650 2026-08-29 00:04 by superceng
[基金申请] 基金不中，共勉 +11 eulota 2026-08-26 11/550 2026-08-28 14:22 by 火星超人xi
[基金申请] 怎么查啊 +6 huang1991js 2026-08-26 6/300 2026-08-28 08:42 by winsaint
[基金申请] 哪位高人中了，把查询到的截图贴出来让我看看，让我长长见识 +5 yuleib84 2026-08-26 6/300 2026-08-28 00:02 by yudaoqian88
[基金申请] 为什么 国际(地区)合作与交流项目 没有放榜？ 10+3 majunge000 2026-08-26 11/550 2026-08-27 08:42 by 北京莱茵编辑
[基金申请] 我不理解！ +15 Edward_pc 2026-08-26 23/1150 2026-08-26 20:34 by zzuzxg
[基金申请] 2026年8月25日国自然放榜前突然收到列入评审专家邮件，有关系吗？ +25 木水思豆 2026-08-25 28/1400 2026-08-26 14:53 by draco1987
[基金申请] 国合里面能看到了 +7 一怀馨秋 2026-08-26 7/350 2026-08-26 11:23 by zhaosm1982
[基金申请] 国际合作可查了，中了面上 (EPI+1)(金币+50) +18 Ldrop2023 2026-08-26 18/900 2026-08-26 11:15 by cmrandy
[基金申请] 项目信息和经费信息在系统里都可以看到了 +6 wittyboy 2026-08-26 14/700 2026-08-26 10:55 by wittyboy
[基金申请] 某些机构，以效率低为荣，以效率低作为存在感 +9 yuleib84 2026-08-25 10/500 2026-08-25 17:14 by alexon
[基金申请] 如果此刻你正在为国基感到焦虑，不妨来听听这首《基金之外》 +8 scalable 2026-08-24 8/400 2026-08-25 12:52 by jnhyjjm
信息提示
关闭
请填处理意见
关闭