| 查看: 1149 | 回复: 1 | ||
[求助]
cDNA克隆问题求助！先谢过了！
|
|
各位大神们，最近克隆碰到了坎儿，能不能过的去心里很没底，恳请各位帮忙仔细分析下原因，谢过了！ 首先，我需要克隆的是一个基因的cDNA全长，引物设计从ATG开始，到终止子前结束。一共用了两种克隆方法，gateway和topo克隆。两次方法所使用的cDNA模板来自两管样品。 然后，gateway克隆筛选到了4个阳性菌落，topo克隆得到的更多。我用M13引物和M13-Rv测序确定片段的确插入进去了。接着，我设计了分段引物，检查是否有突变。这时问题出现了，一共分段测序了3个质粒，2个来自gateway,1个来自topo。测序结果却显示3个质粒同时在同一地方测出了32个碱基的内含子。由于不是3的倍数，应该不是什么可变剪接。 看着辛辛苦苦做出的阳性克隆，我迷茫了，到底是什么原因呢？模板问题基本排除了，方法也用了两种。却得到这样的结果。 最后还有一个问题，我发现topo克隆出现反向插入的几率还蛮高的，问题是在提质粒前我已经M13和目的基因里的特异引物进行了PCR，为什么还会出现反向插入呢？ 问题稍微多了些，麻烦各位大神一定要帮帮忙啊，不胜感激！ |
回复此楼» 猜你喜欢
Wnt-C59：PORCN靶向化学探针，Wnt信号通路阻断机制与科研应用全解析
已经有0人回复
-
Fexaramine：肠道限制性FXR化学探针，结构特征与信号通路研究全解析
已经有0人回复
-
化学工程及工业化学论文润色/翻译怎么收费?
已经有272人回复
-
NVS-STG2：靶向STING跨膜域的分子胶类激动剂，结构特征与寡聚化机制研究全解析
已经有0人回复
-
DOTA-GPC3肽（CAS 3066439-94-6）：双功能分子探针前体的结构特征与标记应用解析
已经有0人回复
-
科研用 TLR7/8 双激动剂怎么选？现货与质控要点
已经有0人回复
-
SEL120-34A HCl：CDK8/CDK19高选择性激酶抑制剂
已经有0人回复
-
氢氧化钾活化操作
已经有18人回复
-
散金
已经有68人回复
-
生物质超级电容器
已经有0人回复
» 本主题相关价值贴推荐，对您同样有帮助:
- 实时荧光定量 相同基因不同处理条件下的相对定量
已经有4人回复
- 肝微粒体体外实验操作细节（新手求教）
已经有20人回复
- 测序后的DNA序列与预测的有几个碱基不同，怎么办
已经有18人回复
- pcr，RACE,低表达量基因的克隆
已经有8人回复
- 【求助/交流】从RNA到cDNA合成再到克隆PCR的实验技巧和操作细节问题若干，寻求解答
已经有12人回复
2楼2013-12-11 18:44:01
20