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[求助]
cDNA克隆问题求助！先谢过了！
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各位大神们，最近克隆碰到了坎儿，能不能过的去心里很没底，恳请各位帮忙仔细分析下原因，谢过了！ 首先，我需要克隆的是一个基因的cDNA全长，引物设计从ATG开始，到终止子前结束。一共用了两种克隆方法，gateway和topo克隆。两次方法所使用的cDNA模板来自两管样品。 然后，gateway克隆筛选到了4个阳性菌落，topo克隆得到的更多。我用M13引物和M13-Rv测序确定片段的确插入进去了。接着，我设计了分段引物，检查是否有突变。这时问题出现了，一共分段测序了3个质粒，2个来自gateway,1个来自topo。测序结果却显示3个质粒同时在同一地方测出了32个碱基的内含子。由于不是3的倍数，应该不是什么可变剪接。 看着辛辛苦苦做出的阳性克隆，我迷茫了，到底是什么原因呢？模板问题基本排除了，方法也用了两种。却得到这样的结果。 最后还有一个问题，我发现topo克隆出现反向插入的几率还蛮高的，问题是在提质粒前我已经M13和目的基因里的特异引物进行了PCR，为什么还会出现反向插入呢？ 问题稍微多了些，麻烦各位大神一定要帮帮忙啊，不胜感激！ |
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