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lihehemumu银虫 (小有名气)
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[求助]
T4 PNK 和 Ligase 已有1人参与
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实验是这样： 试剂公司合成的DNA两端都是羟基。 我先磷酸化其中一条短ssDNA（A）的5‘，23bases，然后加入另外一条ssDNA（B）15bases，和一个更短的ssDNA（C）10bases，C与A和B都有部分互补，为的是把A和B拉近进行下一步的连接。简单的说就是要把A和B连接成一条长链。 磷酸化用的是thermo T4 PNK，连接用thermo T4 Ligase。 现在问题是连不上，不知道为什么。PNK用37度30min，然后加B和C后杂交2h，再Ligase是22度1h。Buffer用的是PNK的Buffer,跟Ligase相差不大： 10×：500mM Tris-HCl，100mM MgCl2，pH 7.6。 另外除了跑胶，还有别的办法鉴定是否连接上吗？ 求指导！  |
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