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赤兔绝尘

新虫 (初入文坛)

[求助] 菜鸟求教native-page的两个问题

小弟最近在跑同工酶的native-page,发现结果出来后有几条带,但是条带都连在一起,很难分辨,本人用的浓缩胶4%,分离胶8%~10%,试过6~15%的分离胶,发现差别不大,应该怎么办?还有那个酶的提取液用什么比较好?我试过几种浓度的PBS和Tris-Hcl,都差别不大,最近实验结果出不来,闷得慌,求大神解答~
菜鸟求教native-page的两个问题
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菜鸟求教native-page的两个问题-1
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cicelyzh

铁杆木虫 (职业作家)

【答案】应助回帖

★ ★ ★ ★ ★ ★ ★
感谢参与,应助指数 +1
kx444555: 金币+2, 鼓励交流 2013-12-09 10:48:27
赤兔绝尘: 金币+5, 有帮助 2013-12-11 14:03:54
native-page的分辨率比SDS-PAGE低很正常。一般做nativ-PAGE可以做in-gel酶活检测或者western blot看某一特定的蛋白。你做非变性胶的目的是什么?
2楼2013-12-09 03:33:09
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赤兔绝尘

新虫 (初入文坛)

引用回帖:
2楼: Originally posted by cicelyzh at 2013-12-09 03:33:09
native-page的分辨率比SDS-PAGE低很正常。一般做nativ-PAGE可以做in-gel酶活检测或者western blot看某一特定的蛋白。你做非变性胶的目的是什么?

我是想做种子的萌发动态酶活性检测的。可是现在几条带都堆在一起不好分辨啊...想要把它拉开该咋办啊~
3楼2013-12-09 17:16:55
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cicelyzh

铁杆木虫 (职业作家)

引用回帖:
3楼: Originally posted by 赤兔绝尘 at 2013-12-09 17:16:55
我是想做种子的萌发动态酶活性检测的。可是现在几条带都堆在一起不好分辨啊...想要把它拉开该咋办啊~...

你做的目标酶的分子量接近?试试改变胶的浓度。实在太接近的条带也没有好的办法。
4楼2013-12-10 04:06:51
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赤兔绝尘

新虫 (初入文坛)

引用回帖:
4楼: Originally posted by cicelyzh at 2013-12-10 04:06:51
你做的目标酶的分子量接近?试试改变胶的浓度。实在太接近的条带也没有好的办法。...

好吧,我试着改一下胶的浓度还有电压以及配置新的溴酚蓝试下。谢谢
5楼2013-12-11 14:03:25
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lcy198405

金虫 (小有名气)

试试减少上样量,降为原先的四分之一,再根据结果调整
6楼2013-12-12 09:52:38
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alman001

铜虫 (小有名气)

引用回帖:
2楼: Originally posted by cicelyzh at 2013-12-09 03:33:09
native-page的分辨率比SDS-PAGE低很正常。一般做nativ-PAGE可以做in-gel酶活检测或者western blot看某一特定的蛋白。你做非变性胶的目的是什么?

我也想做native PAGE,然后做您之后说的in-gel酶活检测,请问您做过后续的酶活检测吗,复杂吗,是不是根据不同酶的催化功能决定的?我想将我的基因做原核表达后纯化蛋白然后跑native-PAGE,之后做酶活检测,这样合理吗?谢谢哈
有事做,无事争
7楼2013-12-12 13:49:56
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