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赤兔绝尘

新虫 (初入文坛)

[求助] 菜鸟求教native-page的两个问题

小弟最近在跑同工酶的native-page，发现结果出来后有几条带，但是条带都连在一起，很难分辨，本人用的浓缩胶4%，分离胶8%~10%，试过6~15%的分离胶，发现差别不大，应该怎么办？还有那个酶的提取液用什么比较好？我试过几种浓度的PBS和Tris-Hcl，都差别不大，最近实验结果出不来，闷得慌，求大神解答~
菜鸟求教native-page的两个问题
IMG_0047.JPG


菜鸟求教native-page的两个问题-1
IMG_0048.JPG
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1楼 2013-12-08 18:59:28
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cicelyzh

铁杆木虫 (职业作家)

【答案】应助回帖

★ ★ ★ ★ ★ ★ ★
感谢参与，应助指数 +1
kx444555: 金币+2, 鼓励交流 2013-12-09 10:48:27
赤兔绝尘: 金币+5, ★有帮助 2013-12-11 14:03:54
native-page的分辨率比SDS-PAGE低很正常。一般做nativ-PAGE可以做in-gel酶活检测或者western blot看某一特定的蛋白。你做非变性胶的目的是什么？
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2楼2013-12-09 03:33:09
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赤兔绝尘

新虫 (初入文坛)
引用回帖:
2楼: Originally posted by cicelyzh at 2013-12-09 03:33:09
native-page的分辨率比SDS-PAGE低很正常。一般做nativ-PAGE可以做in-gel酶活检测或者western blot看某一特定的蛋白。你做非变性胶的目的是什么？

我是想做种子的萌发动态酶活性检测的。可是现在几条带都堆在一起不好分辨啊...想要把它拉开该咋办啊~
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3楼2013-12-09 17:16:55
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cicelyzh

铁杆木虫 (职业作家)
引用回帖:
3楼: Originally posted by 赤兔绝尘 at 2013-12-09 17:16:55
我是想做种子的萌发动态酶活性检测的。可是现在几条带都堆在一起不好分辨啊...想要把它拉开该咋办啊~...

你做的目标酶的分子量接近？试试改变胶的浓度。实在太接近的条带也没有好的办法。
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4楼2013-12-10 04:06:51
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赤兔绝尘

新虫 (初入文坛)
引用回帖:
4楼: Originally posted by cicelyzh at 2013-12-10 04:06:51
你做的目标酶的分子量接近？试试改变胶的浓度。实在太接近的条带也没有好的办法。...

好吧，我试着改一下胶的浓度还有电压以及配置新的溴酚蓝试下。谢谢
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5楼2013-12-11 14:03:25
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lcy198405

金虫 (小有名气)
试试减少上样量，降为原先的四分之一，再根据结果调整
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6楼2013-12-12 09:52:38
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alman001

铜虫 (小有名气)
引用回帖:
2楼: Originally posted by cicelyzh at 2013-12-09 03:33:09
native-page的分辨率比SDS-PAGE低很正常。一般做nativ-PAGE可以做in-gel酶活检测或者western blot看某一特定的蛋白。你做非变性胶的目的是什么？

我也想做native PAGE，然后做您之后说的in-gel酶活检测，请问您做过后续的酶活检测吗，复杂吗，是不是根据不同酶的催化功能决定的？我想将我的基因做原核表达后纯化蛋白然后跑native-PAGE，之后做酶活检测，这样合理吗？谢谢哈
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有事做，无事争
7楼2013-12-12 13:49:56
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