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l刘莉娜

新虫 (小有名气)

[交流] 重叠pcR 已有2人参与

我想把大小为11kb的基因片段和大小为3kb的基因片段用重叠pcR连到一起，但不知道能不能行得通，请各位虫友指导一下，非常感谢！
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1楼 2013-11-16 19:02:55
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gyesang

荣誉版主 (著名写手)

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小木虫: 金币+0.5, 给个红包，谢谢回帖
丝毫没有问题，就普通的overlap PCR就可以达到你的目的
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2楼2013-11-16 23:32:35
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liygmail

至尊木虫 (职业作家)
★
小木虫: 金币+0.5, 给个红包，谢谢回帖
可行，在设计引物时，注意两片段，内引物重叠区25碱基以上，
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3楼2013-11-17 00:30:09
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l刘莉娜

新虫 (小有名气)
引用回帖:
2楼: Originally posted by gyesang at 2013-11-16 23:32:35
丝毫没有问题，就普通的overlap PCR就可以达到你的目的

你好，我现在用Overlap怎么也p不出来，该怎么办？内置引物有50bp.
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4楼2013-12-03 15:54:18
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l刘莉娜

新虫 (小有名气)
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3楼: Originally posted by liygmail at 2013-11-17 00:30:09
可行，在设计引物时，注意两片段，内引物重叠区25碱基以上，

你好，我的内置引物有50bp.可是我现在用Overlap怎么也p不出来，该怎么办？
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5楼2013-12-03 15:55:04
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liygmail

至尊木虫 (职业作家)
★
小木虫: 金币+0.5, 给个红包，谢谢回帖
引用回帖:
5楼: Originally posted by l刘莉娜 at 2013-12-03 15:55:04
你好，我的内置引物有50bp.可是我现在用Overlap怎么也p不出来，该怎么办？...

内置引物有50bp，可是这两条引物间重叠区究竟是多少呢？请检查一下，
此外需注意的是，扩增14kb的长片段，应该选用适合的酶
建立重叠pcr反应体系时，作为模板的11kb和3kb的两个片段应该摩尔比保持1:1，总量100ng/50ul,以上
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6楼2013-12-04 11:33:53
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l刘莉娜

新虫 (小有名气)
引用回帖:
6楼: Originally posted by liygmail at 2013-12-04 11:33:53
内置引物有50bp，可是这两条引物间重叠区究竟是多少呢？请检查一下，
此外需注意的是，扩增14kb的长片段，应该选用适合的酶
建立重叠pcr反应体系时，作为模板的11kb和3kb的两个片段应该摩尔比保持1:1，总量100ng ...

我的重叠部分引物互补部分有49bp,11kb的片段之前我用pushion酶没有p出来，有primerstar酶p出来了，但是现在overlap用这两个酶都p不出来，非常着急！
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7楼2013-12-04 14:45:31
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