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l刘莉娜

新虫 (小有名气)

[交流] 重叠pcR 已有2人参与

我想把大小为11kb的基因片段和大小为3kb的基因片段用重叠pcR连到一起,但不知道能不能行得通,请各位虫友指导一下,非常感谢!
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gyesang

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小木虫: 金币+0.5, 给个红包,谢谢回帖
丝毫没有问题,就普通的overlap PCR就可以达到你的目的
学术问题讨论咨询发邮件gyesang@163.com
2楼2013-11-16 23:32:35
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liygmail

至尊木虫 (职业作家)


小木虫: 金币+0.5, 给个红包,谢谢回帖
可行,在设计引物时,注意两片段,内引物重叠区25碱基以上,
3楼2013-11-17 00:30:09
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l刘莉娜

新虫 (小有名气)

引用回帖:
2楼: Originally posted by gyesang at 2013-11-16 23:32:35
丝毫没有问题,就普通的overlap PCR就可以达到你的目的

你好,我现在用Overlap怎么也p不出来,该怎么办?内置引物有50bp.
4楼2013-12-03 15:54:18
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l刘莉娜

新虫 (小有名气)

引用回帖:
3楼: Originally posted by liygmail at 2013-11-17 00:30:09
可行,在设计引物时,注意两片段,内引物重叠区25碱基以上,

你好,我的内置引物有50bp.可是我现在用Overlap怎么也p不出来,该怎么办?
5楼2013-12-03 15:55:04
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liygmail

至尊木虫 (职业作家)


小木虫: 金币+0.5, 给个红包,谢谢回帖
引用回帖:
5楼: Originally posted by l刘莉娜 at 2013-12-03 15:55:04
你好,我的内置引物有50bp.可是我现在用Overlap怎么也p不出来,该怎么办?...

内置引物有50bp,可是这两条引物间重叠区究竟是多少呢?请检查一下,
此外需注意的是,扩增14kb的长片段,应该选用适合的酶
建立重叠pcr反应体系时,作为模板的11kb和3kb的两个片段应该摩尔比保持1:1,总量100ng/50ul,以上
6楼2013-12-04 11:33:53
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l刘莉娜

新虫 (小有名气)

引用回帖:
6楼: Originally posted by liygmail at 2013-12-04 11:33:53
内置引物有50bp,可是这两条引物间重叠区究竟是多少呢?请检查一下,
此外需注意的是,扩增14kb的长片段,应该选用适合的酶
建立重叠pcr反应体系时,作为模板的11kb和3kb的两个片段应该摩尔比保持1:1,总量100ng ...

我的重叠部分引物互补部分有49bp,11kb的片段之前我用pushion酶没有p出来,有primerstar酶p出来了,但是现在overlap用这两个酶都p不出来,非常着急!
7楼2013-12-04 14:45:31
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