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Hairlessape

新虫 (初入文坛)

[求助] 【求助】新手想在目标蛋白后加Flag tag方法请教

实验室有质粒带有目标蛋白,但不带TAG,现在想在蛋白后加flag以用于后期蛋白质提取、纯化。在网上一时没搜寻到资料,故在此发帖。如何从何做起呢,方法有哪些,有经验的虫友请不吝赐教!!!
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jasco

木虫 (正式写手)

引用回帖:
4楼: Originally posted by Hairlessape at 2013-11-12 20:27:55
谢谢回复,我们确实是由酶切位点的,第一种方法我在考虑,等师兄把质粒序列给我就设计引物开始;第二种重组的方式我倒一点都不了解,也没做过。另外我师兄之前讲过另一种方式(不知他有没有try过~~)是直接把FLAG核 ...

看你的质粒多大了,即使扩增出来,一方面可能引入突变,一方面也还要连接转化
7楼2013-11-19 11:21:46
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yang0071

木虫 (职业作家)

【答案】应助回帖

感谢参与,应助指数 +1
追尾的事不安全啊
2楼2013-11-12 17:06:57
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jasco

木虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

★ ★
感谢参与,应助指数 +1
amisking: 金币+2, MolEPI+1, 鼓励发帖交流! 2013-11-12 17:57:44
如果已有的质粒上的目的序列是酶切连上去的,那就
1. 酶切,留载体框架
2.用质粒做模板,pcr目的序列,反向引物上加上flag核酸序列(顺序别反了),回收pcr产物,酶切
3.连接,1+2即可

如果是重组方式构建的,
1.需要原始不带目的序列的载体
2.用质粒做模板,pcr目的序列,反向引物上加上flag核酸序列(顺序别反了)还有重组位点序列,回收pcr产物
3.重组,1+2
3楼2013-11-12 17:14:30
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Hairlessape

新虫 (初入文坛)

引用回帖:
3楼: Originally posted by jasco at 2013-11-12 17:14:30
如果已有的质粒上的目的序列是酶切连上去的,那就
1. 酶切,留载体框架
2.用质粒做模板,pcr目的序列,反向引物上加上flag核酸序列(顺序别反了),回收pcr产物,酶切
3.连接,1+2即可

如果是重组方式构建的, ...

谢谢回复,我们确实是由酶切位点的,第一种方法我在考虑,等师兄把质粒序列给我就设计引物开始;第二种重组的方式我倒一点都不了解,也没做过。另外我师兄之前讲过另一种方式(不知他有没有try过~~)是直接把FLAG核酸序列放在引物中间,直接对质粒扩增,这样能得到全长的新质粒么?
4楼2013-11-12 20:27:55
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