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Hairlessape

新虫 (初入文坛)

[求助] 【求助】新手想在目标蛋白后加Flag tag方法请教

实验室有质粒带有目标蛋白，但不带TAG，现在想在蛋白后加flag以用于后期蛋白质提取、纯化。在网上一时没搜寻到资料，故在此发帖。如何从何做起呢，方法有哪些，有经验的虫友请不吝赐教！！！
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1楼 2013-11-12 17:04:06
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回帖置顶 ( 共有1个 )

jasco

木虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

★ ★
感谢参与，应助指数 +1
amisking: 金币+2, MolEPI+1, 鼓励发帖交流！ 2013-11-12 17:57:44
如果已有的质粒上的目的序列是酶切连上去的，那就
1. 酶切，留载体框架
2.用质粒做模板，pcr目的序列，反向引物上加上flag核酸序列（顺序别反了），回收pcr产物，酶切
3.连接，1+2即可

如果是重组方式构建的，
1.需要原始不带目的序列的载体
2.用质粒做模板，pcr目的序列，反向引物上加上flag核酸序列（顺序别反了）还有重组位点序列，回收pcr产物
3.重组，1+2
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3楼2013-11-12 17:14:30
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普通回帖

yang0071

木虫 (职业作家)

【答案】应助回帖

感谢参与，应助指数 +1
追尾的事不安全啊
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2楼2013-11-12 17:06:57
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Hairlessape

新虫 (初入文坛)
引用回帖:
3楼: Originally posted by jasco at 2013-11-12 17:14:30
如果已有的质粒上的目的序列是酶切连上去的，那就
1. 酶切，留载体框架
2.用质粒做模板，pcr目的序列，反向引物上加上flag核酸序列（顺序别反了），回收pcr产物，酶切
3.连接，1+2即可

如果是重组方式构建的， ...

谢谢回复，我们确实是由酶切位点的，第一种方法我在考虑，等师兄把质粒序列给我就设计引物开始；第二种重组的方式我倒一点都不了解，也没做过。另外我师兄之前讲过另一种方式（不知他有没有try过~~）是直接把FLAG核酸序列放在引物中间，直接对质粒扩增，这样能得到全长的新质粒么？
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4楼2013-11-12 20:27:55
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Hairlessape

新虫 (初入文坛)
引用回帖:
2楼: Originally posted by yang0071 at 2013-11-12 17:06:57
追尾的事不安全啊

谢谢回复，不过此话何解，不懂，介意详述么？
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5楼2013-11-12 20:29:42
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yang0071

木虫 (职业作家)
引用回帖:
5楼: Originally posted by Hairlessape at 2013-11-12 20:29:42
谢谢回复，不过此话何解，不懂，介意详述么？...

你想从dna还是rna都能够提取出来  做pcr
现在还有直接从组织做rt-pcr的，裂解液都不要加，而且还不贵
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6楼2013-11-14 08:58:42
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jasco

木虫 (正式写手)
引用回帖:
4楼: Originally posted by Hairlessape at 2013-11-12 20:27:55
谢谢回复，我们确实是由酶切位点的，第一种方法我在考虑，等师兄把质粒序列给我就设计引物开始；第二种重组的方式我倒一点都不了解，也没做过。另外我师兄之前讲过另一种方式（不知他有没有try过~~）是直接把FLAG核 ...

看你的质粒多大了，即使扩增出来，一方面可能引入突变，一方面也还要连接转化
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7楼2013-11-19 11:21:46
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