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zhangbaocau新虫 (小有名气)
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[求助]
17cm 非线性胶条双向电泳图谱求助
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17cm 非线性胶条双向电泳图谱求助 图为真菌胞内蛋白双向电泳图，样品制备采用TCA-丙酮法， 将1克冻干菌体用液氮研磨至粉末，加入TCA-丙酮质量体积比为10%的混合液15ml和0.07%DTT, ，-20 ℃沉淀4h或过夜, 4℃ 14000rpm离心20 min,并用含有DTT的丙酮洗涤以除去TCA，真空干燥以除去丙酮。重悬于裂解液(7 M尿素、2 M硫脲、2%CHAPS、1% DTT、0.5% Bio-Lyte Ampholyte)中，20℃ 14000rpm离心30 min，吸取上清液，测浓度分装待用； pH3-10 ，nonlinear,17cm 胶条，操作和等点聚焦条件等按bio-rad公司说的来的并做适当修改，等电聚焦程序设置 17cm胶条 水化 50V 14小时（20℃） 主动水化 S1 150V 快速 3.5小时 除盐 S2 300V 快速 1小时 除盐 S3 600V 快速 1小时 除盐 S4 1200V 快速 1小时 除盐 S5 10000V 线性 4.5小时 升压 S4 10000V 快速 60,000伏小时 聚焦 S5 500V 快速 任意时间 保持 选择所放置的胶条数。 设置每根胶条的极限电流。（50-70mA/根） 设置等电聚焦时的温度。（20℃） SDS电泳，16mA/gel，30min, 30mA/gel,7 h. 考马斯亮蓝CBB G250染色 图谱还是有问题，求高手指点，谢谢！ 主要存在以下问题： 1 CK和处理上样量经bradford法测定，都以500mg与水化液混合（由于混合液有剩余，故实际上样量都是420mg），但从图片可看出，CK的总体蛋白含量明显高于处理的总体蛋白含量，基本是每个点都高一些（但两者?A样量和IEF程序完全一样啊），这样后面找差异大的点切胶估计不行啊，不知从哪里改进，？？ 2 CK和处理胶的最左边（pH3-10）有较强的横纵条纹，难道?A样量还是太高了吗，还是IEF程序要改变？？ 3若同时跑 CK和处理2胶条的运行条件稳定后，在去同时跑6胶条（CK和处理的3个重复），6胶条同时聚集，IEF程序完全不变，应该可以吧？  图1 CK ，pH3-10从左至右  图2处理，pH3-10从左至右 |
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2楼2013-11-09 08:49:21
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