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zhangbaocau

新虫 (小有名气)

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[求助] 17cm 非线性胶条双向电泳图谱求助

17cm 非线性胶条双向电泳图谱求助
图为真菌胞内蛋白双向电泳图，样品制备采用TCA-丙酮法，
将1克冻干菌体用液氮研磨至粉末，加入TCA-丙酮质量体积比为10%的混合液15ml和0.07%DTT, ，-20 ℃沉淀4h或过夜, 4℃ 14000rpm离心20 min,并用含有DTT的丙酮洗涤以除去TCA，真空干燥以除去丙酮。重悬于裂解液(7 M尿素、2 M硫脲、2%CHAPS、1%  DTT、0.5% Bio-Lyte Ampholyte)中，20℃ 14000rpm离心30 min，吸取上清液，测浓度分装待用；
pH3-10 ，nonlinear,17cm 胶条，操作和等点聚焦条件等按bio-rad公司说的来的并做适当修改，等电聚焦程序设置
17cm胶条
水化 50V 14小时（20℃）主动水化
S1 150V 快速 3.5小时除盐
S2 300V    快速      1小时除盐
S3 600V    快速      1小时除盐
S4 1200V    快速      1小时除盐
S5 10000V 线性 4.5小时升压
S4 10000V 快速 60,000伏小时聚焦
S5 500V 快速任意时间保持
      选择所放置的胶条数。
      设置每根胶条的极限电流。（50-70mA/根）
      设置等电聚焦时的温度。（20℃）

SDS电泳，16mA/gel，30min, 30mA/gel,7 h. 考马斯亮蓝CBB G250染色
图谱还是有问题，求高手指点，谢谢！
主要存在以下问题：
1 CK和处理上样量经bradford法测定，都以500mg与水化液混合（由于混合液有剩余，故实际上样量都是420mg），但从图片可看出，CK的总体蛋白含量明显高于处理的总体蛋白含量，基本是每个点都高一些（但两者?A样量和IEF程序完全一样啊），这样后面找差异大的点切胶估计不行啊，不知从哪里改进，？？
2 CK和处理胶的最左边（pH3-10）有较强的横纵条纹，难道?A样量还是太高了吗，还是IEF程序要改变？？
3若同时跑 CK和处理2胶条的运行条件稳定后，在去同时跑6胶条（CK和处理的3个重复），6胶条同时聚集，IEF程序完全不变，应该可以吧？

图1 CK ，pH3-10从左至右