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herjasmine

新虫 (初入文坛)

[求助] WB上样量不同导致结果不同，哪一次的结果可信呢？

最近几次WB做下来目的蛋白control和给药组都没有差异（条带清晰，蛋白内参颜色稍淡）。然后有老师建议减少上样量。说上样量太大，抗体饱和后可能导致怎么做都没有差异。于是我降低上样量做了一次，果然又有差异了。正好另外一个师姐在做其他蛋白，因为我所做的目的蛋白转膜后也在她那张膜上。她和我用的是同一批样品。所以我就请她把那张膜剪开，顺便把我要做的膜也孵上了抗体看看。然后她的上样量介于我第一次和第二次之间。抗体浓度比第一次降低了一些。做出来结果又没有差异了。我被搞晕了。到底哪一次的结果才可信啊？而且条带都比较清楚。而有差异的也是比较明显的那种。你们遇到这种情况怎么办呢？重复几次？要是每次重复结果都不一样那又怎么办呢？
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1楼 2013-11-08 10:56:01
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yipan

铜虫 (职业作家)

【答案】应助回帖

感谢参与，应助指数 +1
你是自己配胶还是买的成品预制胶？成品预制胶没有重复性差异，自己配胶的话多少会出现差异性。另外MARK标记每次应固定在一个位置，方便对照。上样量可以多重复几次，多做几个批次，如果时间和样本足够的话。这样就可以得到准确的结果。
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2楼2013-11-08 14:19:54
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cicelyzh

铁杆木虫 (职业作家)

【答案】应助回帖

感谢参与，应助指数 +1
一定浓度的抗体（任何稀释度下）都有其线性工作范围，超过这个范围的信号可能饱和或者衰减很快甚至无法检测到。所以，你需要对标准品或者对照样品的不同上样量跑胶做WB。你给药组的样品的信号强度需要落在你检测线性范围内。然后根据对照组或者标准品做的线性梯度来估算给药组的蛋白表达量。
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3楼2013-11-09 09:27:31
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herjasmine

新虫 (初入文坛)
引用回帖:
3楼: Originally posted by cicelyzh at 2013-11-09 09:27:31
一定浓度的抗体（任何稀释度下）都有其线性工作范围，超过这个范围的信号可能饱和或者衰减很快甚至无法检测到。所以，你需要对标准品或者对照样品的不同上样量跑胶做WB。你给药组的样品的信号强度需要落在你检测线性 ...

那可以说我做出来有差异那次的是可信的吗？因为3次里我做的那次上样量是最小的。而抗体浓度和第一次一样，又比第二次高。可不可以这样认为呢（当然还需要再次实验验证）？另外，如果我那次的条件做出来结果是有差异的，那我是不是就可以不用再做线性梯度了？谢谢！
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4楼2013-11-11 09:17:57
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凌波丽

专家顾问 (知名作家)

【答案】应助回帖

感谢参与，应助指数 +1
你用别的费WB蛋白质-蛋白质相互作用方法检测一下，看看与那一次WB的实验结果相同。最简单的方法：免疫共沉淀,pull down.
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5楼2013-11-11 10:26:26
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cicelyzh

铁杆木虫 (职业作家)

【答案】应助回帖

★ ★ ★ ★ ★
herjasmine: 金币+5, ★★★★★最佳答案, 很好！ 2013-11-12 09:25:06
引用回帖:
4楼: Originally posted by herjasmine at 2013-11-11 09:17:57
那可以说我做出来有差异那次的是可信的吗？因为3次里我做的那次上样量是最小的。而抗体浓度和第一次一样，又比第二次高。可不可以这样认为呢（当然还需要再次实验验证）？另外，如果我那次的条件做出来结果是有差异 ...

如果你打算用western的暴光灰度来说明表达量的多少，就需要做线性梯度，这是做western用于半定量检测蛋白量的基本原理。也便于你做生物重复后的均值和误差处理。
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6楼2013-11-11 10:30:54
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guoke7072

新虫 (初入文坛)
引用回帖:
6楼: Originally posted by cicelyzh at 2013-11-11 10:30:54
如果你打算用western的暴光灰度来说明表达量的多少，就需要做线性梯度，这是做western用于半定量检测蛋白量的基本原理。也便于你做生物重复后的均值和误差处理。...

做线性梯度是什么意思啊?我做WB的时候遇到了和楼主相似的问题，同一个的样，做出来的结果却不一样，第一次做目的蛋白几乎没变化，第二次做目的蛋白上升，条件几乎没变，抗体重复使用，结果重复性不高，我经常遇到这样的情况，不知道为什么。
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7楼2015-05-29 15:59:22
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