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彭艳prene

新虫 (初入文坛)

[求助] 载体构建

本人做载体构建快半年了，载体是pcDNA3.1（-），大小5k左右，目的片段大小2.7k，我分为两段连，先将两段连到T载体上，测序验证没有问题，然后酶切，分别连到目的载体上，一段已经连上去了经酶切没有问题，但是另一段就是连不上去，卡在最后一步很久，跪求各位高人有类似经验的指导指导，小妮子不胜感激
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1楼 2013-10-28 21:32:37
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wilzu

木虫 (初入文坛)

【答案】应助回帖

★
感谢参与，应助指数 +1
gyesang: 金币+1, 鼓励交流！ 2013-10-29 01:11:57
是双酶分步克隆到pcdna3.1的mcs ,两个片段两端都有设计酶切位点？

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2楼2013-10-28 23:35:19
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kehan777

木虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

★
感谢参与，应助指数 +1
gyesang: 金币+1, 鼓励交流！ 2013-10-29 01:12:30
酶切后有没有电泳鉴定一下结果，如果胶回收的话，回收率又是多少？你的连接体系有没有问题？还有难连接的话，连接时间可以延长一些
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3楼2013-10-28 23:39:44
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wuyao0513

新虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

★ ★
感谢参与，应助指数 +1
gyesang: 金币+2, 鼓励交流！ 2013-10-29 16:36:51
你可以先在T载体上构建好含有两个片段，最后再转到目的载体上！
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4楼2013-10-29 11:51:47
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彭艳prene

新虫 (初入文坛)
引用回帖:
2楼: Originally posted by wilzu at 2013-10-28 23:35:19
是双酶分步克隆到pcdna3.1的mcs ,两个片段两端都有设计酶切位点？

是的，我自己命名A片段和B片段，A片段能连上去，连上去后双酶切验证和测序显示都没有问题，但再把B片段连上去时就有问题了，一直连不成功，有长克隆但挑出来抽质粒很奇怪，质粒大小居然比空载体的片段都小，请问这是什么原因？有木有遇到过这种情况？？？
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5楼2013-10-29 14:51:33
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彭艳prene

新虫 (初入文坛)
引用回帖:
4楼: Originally posted by wuyao0513 at 2013-10-29 11:51:47
你可以先在T载体上构建好含有两个片段，最后再转到目的载体上！

这一步已经做完了
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6楼2013-10-29 14:52:03
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彭艳prene

新虫 (初入文坛)
引用回帖:
3楼: Originally posted by kehan777 at 2013-10-28 23:39:44
酶切后有没有电泳鉴定一下结果，如果胶回收的话，回收率又是多少？你的连接体系有没有问题？还有难连接的话，连接时间可以延长一些

都做过
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7楼2013-10-29 14:52:32
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wilzu

木虫 (初入文坛)

【答案】应助回帖

★ ★
gyesang: 金币+2, 鼓励交流！ 2013-10-29 23:58:04
引用回帖:
5楼: Originally posted by 彭艳prene at 2013-10-29 14:51:33
是的，我自己命名A片段和B片段，A片段能连上去，连上去后双酶切验证和测序显示都没有问题，但再把B片段连上去时就有问题了，一直连不成功，有长克隆但挑出来抽质粒很奇怪，质粒大小居然比空载体的片段都小，请问这 ...

如果两段序列没有大的重复片段 实验设计合理 包括两端酶切位点在载体里都是单一 分步克隆应该不是难事 既然你已经把两段都已经克隆到t载体 为什么不直接p出或直接酶切出完整序列 再
装到表达载体里

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8楼2013-10-29 23:00:18
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天使托

专家顾问 (职业作家)

T.Shen

【答案】应助回帖

感谢参与，应助指数 +1
5kb 连接一个2.7的完全不用分开连接啊？
连接体系设计好一点完全没问题的
不过连接酶用普洛麦格的吧.
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Whenever,Wherever,Anyway!MustRemember:Fight!KeepFighting!NeverGiveUp!
9楼2013-10-30 00:30:10
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ivyvampire

新虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

★ ★
感谢参与，应助指数 +1
gyesang: 金币+2, 鼓励交流！ 2013-10-30 12:48:56
不用分开连吧，我一万连5000都连上啦，NEB 的T4连接酶从周五连到周一连上的
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10楼2013-10-30 10:58:53
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