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qinchen1018

银虫 (初入文坛)

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[求助] Western Blot 目标条带跑不出来，内参条带清晰已有5人参与

各位朋友帮帮忙吧，我是新手，刚学做 western blot，内参条带到是挺清晰，也基本一致，但是我的目标蛋白一个条带都没有，这是为啥啊

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1楼 2013-10-23 14:47:56

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凌波丽

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专业: 生物大分子结构与功能
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【答案】应助回帖

一、Western Blot实验条带没出现的原因分析及解决办法：
      原因分析                                                                      解决办法
1.一抗和二抗失效                                                       1.  更换抗体；选择现用现配的工作液
2.一抗和二抗不匹配                                                    2. 更换为同种同属的同亚型的抗体底物
3.发光液失效                                                             3. 更换新的发光液
4.抗体染色不充分                                                       4. 增加抗体浓度；延长孵育时间
5.被测样品中不含有目的蛋白质或者目的蛋白质含量太低 5. 设置阳性对照。确定标本中是否含有目的蛋白质；
                                                                                 增加样品的上样量。
6. 溶液中有辣根过氧化物酶的抑制剂                      6.用透析和超滤除去所用溶液中如叠氮化钠之类的抑制剂
7.抗体活力降低                                                    7.在抗体活力保存时间内使用抗体；工作液现用现配
二、一抗与二抗的专一性识别检测，就是蛋白质-蛋白质相互作用检测，方法很多，免疫共沉淀、Pull down、MADLI-MS、能量转移、分子筛层析等。