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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » 综合其他 » Western Blot 目标条带跑不出来，内参条带清晰
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qinchen1018

银虫 (初入文坛)

[求助] Western Blot 目标条带跑不出来，内参条带清晰 已有5人参与

各位朋友帮帮忙吧，我是新手，刚学做 western blot，内参条带到是挺清晰，也基本一致，但是我的目标蛋白一个条带都没有，这是为啥啊
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1楼 2013-10-23 14:47:56
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回帖支持 ( 显示支持度最高的前 50 名 )

花开未央

新虫 (初入文坛)

【答案】应助回帖

★ ★ ★ ★ ★
感谢参与，应助指数 +1
qinchen1018: 金币+3 2013-10-23 15:30:21
gyesang: 金币+2, 鼓励交流！ 2013-10-25 13:21:03
那就可能是抗体的问题了，重新优化一下抗体浓度，另外看一下你的目标蛋白是多大的，要是小分子蛋白也许是转过了也不一定的，亦或是大分子的没转印完全，内参很好说明整个操作是没问题了，那只能是从抗体找原因了，祝实验顺利！
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希望~~~
3楼2013-10-23 15:26:52
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daibingling

铁虫 (正式写手)
★ ★
gyesang: 金币+2, 鼓励交流！ 2013-10-25 13:21:40
引用回帖:
4楼: Originally posted by qinchen1018 at 2013-10-23 15:29:44
上样量40微克，内参是GAPDH，目标蛋白是16.5KD、165KD，300mA湿法转膜1h、2h，一抗1:1000稀释，使用odessey成像系统扫膜的

GAPDH.png
...

上样量和转膜时间都没问题，那就把一抗和二抗重新配置。祝好运。
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5楼2013-10-23 17:49:09
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凌波丽

专家顾问 (知名作家)

【答案】应助回帖

一、Western Blot实验条带没出现的原因分析及解决办法 ：
        原因分析                                                                        解决办法         
1.一抗和二抗失效                                                        1.  更换抗体；选择现用现配的工作液
2.一抗和二抗不匹配                                                     2. 更换为同种同属的同亚型的抗体底物
3.发光液失效                                                              3. 更换新的发光液
4.抗体染色不充分                                                        4. 增加抗体浓度；延长孵育时间
5.被测样品中不含有目的蛋白质或者目的 蛋白质含量太低    5. 设置阳性对照。确定标本中是否含有目的蛋白质；
                                                                                    增加样品 的上样量。
6. 溶液中有辣根过氧化物酶的抑制剂                         6.用透析和超滤除去所用溶液中如叠氮化钠之类的抑制剂
7.抗体活力降低                                                     7.在抗体活力保存时间内使用抗体；工作液现用现配
二、一抗与二抗的专一性识别检测，就是蛋白质-蛋白质相互作用检测，方法很多，免疫共沉淀、Pull down、MADLI-MS、能量转移、分子筛层析等。
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12楼2014-07-12 00:48:39
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普通回帖

daibingling

铁虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

★ ★ ★
感谢参与，应助指数 +1
qinchen1018: 金币+2, ★有帮助 2013-10-23 15:30:07
gyesang: 金币+1, 鼓励交流！ 2013-10-25 13:20:51
这个说的有些笼统，显影时目标条带什么情况，具体点才好分析。内参能检测到，说明基本步骤还是没问题的。
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2楼2013-10-23 15:25:24
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qinchen1018

银虫 (初入文坛)
引用回帖:
2楼: Originally posted by daibingling at 2013-10-23 15:25:24
这个说的有些笼统，显影时目标条带什么情况，具体点才好分析。内参能检测到，说明基本步骤还是没问题的。

上样量40微克，内参是GAPDH，目标蛋白是16.5KD、165KD，300mA湿法转膜1h、2h，一抗1:1000稀释，使用odessey成像系统扫膜的
Western Blot 目标条带跑不出来，内参条带清晰
GAPDH.png
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4楼2013-10-23 15:29:44
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zhangxn2010

木虫 (著名写手)

让一切随风飞翔

【答案】应助回帖

★ ★
感谢参与，应助指数 +1
gyesang: 金币+2, 鼓励交流！ 2013-10-25 13:21:34
odessey的仪器做荧光比较好，做化学发光灵敏度不够，需要灵敏度更好的仪器
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一直向前！
6楼2013-10-25 11:18:09
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实验完成时

金虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

★ ★
gyesang: 金币+2, 鼓励回帖交流！ 2013-10-27 01:36:13
一般Western不出目的条带多半是一抗的问题，建议更换一抗
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7楼2013-10-26 22:12:13
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liujiao7952

金虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

一抗特异性不够吧，试着提高1抗浓度试试
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8楼2013-12-09 10:47:10
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jurkat.1640

至尊木虫 (文坛精英)

【答案】应助回帖

内参的表达量都很高，所以容易检测，可能你的目的蛋白表达量太少，不要把目的蛋白与内参放一起显影。
也可能抗体问题，或者目的蛋白的实际位置与预测位置不一样，有的蛋白可以相差几十kDa。
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9楼2013-12-09 18:04:57
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逆天打酱油

金虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

内参太强 遮盖信号
建议分开检测
话说我也是这样的情况 好难过
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10楼2014-04-24 16:05:44
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