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lx0103

新虫 (小有名气)

[求助] 9.0kb载体与2.4kb片段为什么用T4连接酶连接，没有得到阳性克隆？

片段处理方法如下：2.4kb的PCR片段经过跑胶切胶回收，浓度为100ng/ul，然后双酶切，酶切体系如下:4ul 切胶回收的PCR片段 24ul（2.4ug）, BamH1-HF(NEB公司）1.5ul, Not1-HF（NEB公司）1.5ul, 10*Buffer 3ul，共30ul酶切体系，37度酶切过夜。PCR产物双酶切后使用全式金公司凝胶回收试剂盒过柱子纯化，即将30ul反应体系直接加入到3倍体积的溶胶溶液，混匀后直接上柱子纯化，跑胶检测纯化后的片段浓度为40ng/ul。
载体处理方法如下：9.0kb的载体双酶切，双酶切体系如下：5ug载体，BamH1-HF(NEB公司）1.5ul, Not1-HF（NEB公司）1.5ul, 10*Buffer 3ul，用无菌水补足至30ul，也是37度酶切过夜。然后切胶回收大的载体片段，跑胶检测纯化后的载体浓度为20ng/ul。
连接&转化：用NEB公司的T4连接酶进行连接，连接体系如下：片段6.5ul，载体8.5ul，10*buffer 3ul，T4 ligase 2ul，无菌水10ul，总体积30ul，摩尔比为10：1，室温连接1.5h，然后进行转化。做了一个转化质粒的对照，保证转化过程没有出现问题。转化平板在37度生长16h。
结果：转化平板上只长了8个菌落，全部挑取做菌落PCR，发现没有阳性克隆。
请求大家帮我找找原因。
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1楼 2013-10-12 15:41:13
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zhangj0754

木虫 (小有名气)
你的载体跟目的片段的量是不是有点多了啊，好像NEB的酶5’末端的摩尔量有要求的，为什么连接体系是30ul呢，我一般是20ul，载体50到100ng左右，直接取5ul转化。效率挺高的。你的目的片段有没有加保护碱基啊，PCR产物的话加保护碱基才好切的。我一般是连克隆载体后测完序再切的。
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7楼2013-10-13 09:40:21
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yang0071

木虫 (职业作家)

【答案】应助回帖

★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★
感谢参与，应助指数 +1
lx0103: 金币+15, ★有帮助 2013-10-12 16:00:47
PCR产物双酶切后，先跑电泳，再回收。
载体处理同上。
连接温度16度最佳，延长连接时间，或者4度过夜。
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2楼2013-10-12 15:49:46
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lx0103

新虫 (小有名气)
引用回帖:
2楼: Originally posted by yang0071 at 2013-10-12 15:49:46
PCR产物双酶切后，先跑电泳，再回收。
载体处理同上。
连接温度16度最佳，延长连接时间，或者4度过夜。

谢谢！PCR产物先是经过跑胶回收目的片段，然后进行的双酶切，双酶切后还需要再跑胶回收吗？这样回收后的片段浓度会不会很低？
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3楼2013-10-12 15:58:28
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yang0071

木虫 (职业作家)

【答案】应助回帖

引用回帖:
3楼: Originally posted by lx0103 at 2013-10-12 15:58:28
谢谢！PCR产物先是经过跑胶回收目的片段，然后进行的双酶切，双酶切后还需要再跑胶回收吗？这样回收后的片段浓度会不会很低？...

需要，因为不跑胶的话，你回收到的可能包含小片段
浓度不会很低，除非你的回收效率很差
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4楼2013-10-12 16:01:59
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