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关于一氧化氮或一氧化氮合成酶的检测问题
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我将一段一氧化氮合成酶的基因转染进了细胞。现在想检测一下它的表达。有没有同学做过一氧化氮合成酶或一氧化氮的检测？我查到一氧化氮合成酶可以用elisa，western，还有南京建成生物研究所的一氧化氮合成酶检测试剂盒，说是用的比色法，我没太明白这个比色法出来的结果是什么样的？观察颜色的深浅吗？有没有同学做过？ 一氧化氮的检测也是有试剂盒，分荧光法和比色法。可是一氧化氮不是微溶于水么？怎么收集呢？在细胞培养过程中不会损失吗？ 有做过这个的同学请给我个建议？哪个方法比较好，并且比较经济。我只要能证明我转染的细胞表达得比没转染的多就行了。半定量就好。 |
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wizardfan: 金币+3, 感谢详细解答 2013-10-13 07:50:16
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使用说明： 1. 取出Griess Reagent I和II，使回复室温。 2. 用待测样品所用溶液稀释标准品(1-100μM)。 例如样品为细胞培养液上清，细胞培养液为DMEM＋10%FBS，则用DMEM＋10%FBS稀释标准品。通常标准品 的浓度可取0, 1, 2, 5, 10, 20, 40, 60, 100μM。 3. 按50μl/孔，在96孔板中加入标准品及样品。 样品为培养液上清，可以直接取样，如果有可沉淀物则需离心后取上清。如样品为细胞或组织，可以快 速冻融裂解，然后离心沉淀取上清，体积不足50μl可以用重蒸水或0.9%NaCl稀释(相应地标准品也需用 重蒸水或0.9%NaCl稀释)。细胞或组织也可以用用于Western或IP的裂解液(无需添加抑制剂)裂解，同样 标准品也需相应稀释。碧云天生产的Western及IP细胞裂解液(P0013)或各种RIPA裂解液裂解细胞后适用 于一氧化氮的测定。 4. 按50μl/孔，在各孔中加入室温Griess Reagent I。 5. 按50μl/孔，各孔中加入室温Griess Reagent II。 6. 540nm 测定吸光度。 如无540nm滤光片，520-560nm的滤光片也可。如无酶标仪或合适的滤光片，也可以通过目测比色，确定 样品中一氧化氮的浓度。目测比色时标准品需要更为精细的浓度梯度。 |
3楼2013-10-11 16:58:50
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