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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » 综合其他 » 酵母平板
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静安jingan

铁杆木虫 (职业作家)

[求助] 酵母平板

刚做了转化，用的是毕赤酵母，涂板后3天长出来的菌落so奇怪，以至于我就不淡定了，平板是倒置的，结果菌落是细丝状的垂直于平板生长，也是白色的，当然平板上也有那种很保守形态的酵母菌落，目前就是想知道这种到底是不是酵母，这个平板上的单克隆能不能用呢
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让复杂的事情变简单，简单的事情更简单
1楼 2013-10-08 10:29:41
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shyh1983

金虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★
感谢参与，应助指数 +1
kx444555: 金币+3, 鼓励交流 2013-10-08 16:00:24
静安jingan: 金币+8 2013-10-09 09:32:32
个人认为，首先应该确认平板上其他单克隆菌落的形态是否为酵母的典型形态（如菌落饱满、圆润、乳白色），是否有酵母特有的气味。确认确实如此之后，建议楼主进行高拷贝筛选，并进行PCR鉴定，这样就确保筛选到阳性转化子，而且如能筛选到高拷贝转化子在理论上能显著提高表达量，对后续的表达纯化非常有利。
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2楼2013-10-08 14:48:02
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静安jingan

铁杆木虫 (职业作家)
引用回帖:
2楼: Originally posted by shyh1983 at 2013-10-08 14:48:02
个人认为，首先应该确认平板上其他单克隆菌落的形态是否为酵母的典型形态（如菌落饱满、圆润、乳白色），是否有酵母特有的气味。确认确实如此之后，建议楼主进行高拷贝筛选，并进行PCR鉴定，这样就确保筛选到阳性转 ...

怎么搞拷贝筛选啊，第一次听说。
我刚刚才想到一种可能性，我的抗生素会见光失效，所以是涂板的时候提前涂上去的，先涂抗生素，再涂转化后的菌液，在涂的时候可能会某种原因，使菌液在抗生素下层，所以可以生长，到抗生素那层的时候由于没有抗性，外围的就没有长起来，但是内部没有直接接触抗生素，所以可以生长，所以就形成了这种古怪的形态。估计假阳性的可能大。
早上涂片看了一下，都是酵母菌，唯一的区别就是普通菌落大部分处于生长期，分裂的很少；而菌落形状奇怪的则大部分处于分裂期
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让复杂的事情变简单，简单的事情更简单
3楼2013-10-08 14:54:12
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ndsc

铁虫 (初入文坛)

【答案】应助回帖

★ ★ ★ ★ ★
感谢参与，应助指数 +1
静安jingan: 金币+5 2013-10-09 09:32:41
没错的，鉴定是否阳性就ok了，一般双转，双筛要2-3天，双转3-4筛要5-8天。没问题的放心吧。
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4楼2013-10-08 17:57:20
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cuicchao

金虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

★ ★ ★ ★ ★
感谢参与，应助指数 +1
静安jingan: 金币+5, ★有帮助 2013-10-09 09:33:01
高拷贝不是用G418筛选么，为什么你的抗生素见光分解？不知道你的平板是不是MD平板，涂了MD平板的可以直接高拷贝筛选的
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好心态；年轻派
5楼2013-10-08 22:30:00
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shyh1983

金虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

★ ★ ★ ★ ★ ★ ★
静安jingan: 金币+7, ★★★很有帮助 2013-10-09 09:33:24
引用回帖:
3楼: Originally posted by 静安jingan at 2013-10-08 14:54:12
怎么搞拷贝筛选啊，第一次听说。
我刚刚才想到一种可能性，我的抗生素会见光失效，所以是涂板的时候提前涂上去的，先涂抗生素，再涂转化后的菌液，在涂的时候可能会某种原因，使菌液在抗生素下层，所以可以生长， ...

高拷贝筛选就是利用抗生素进行梯度筛选。pPIC3.5K/pPIC9K等载体用G418梯度平板筛选，pPICZα系列的载体用博来霉素（Zeocin）筛选，根据楼主的描述所用抗生素会见光分解，那么猜测楼主所用的抗生素应该是Zeocin。方法是先将所有的转化子在96孔板上连续转接培养三次，每次培养1-2天，使菌体浓度渐趋一致，在分别点接于不同抗生素浓度的平板上（取1ul），浓度梯度可以设置为：0,0.25,0.5,1.0,2.0mg/ml。然后挑选在最高抗生素浓度平板上生长的菌落，培养后提取基因组利用AOX1通用引物或AOX1 3‘下游引物和α-factor组合引物或者是用目的基因特异性引物鉴定筛选到的转化子。
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6楼2013-10-09 08:24:40
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静安jingan

铁杆木虫 (职业作家)
引用回帖:
6楼: Originally posted by shyh1983 at 2013-10-09 08:24:40
高拷贝筛选就是利用抗生素进行梯度筛选。pPIC3.5K/pPIC9K等载体用G418梯度平板筛选，pPICZα系列的载体用博来霉素（Zeocin）筛选，根据楼主的描述所用抗生素会见光分解，那么猜测楼主所用的抗生素应该是Zeocin。方 ...

哦，了解了，谢谢
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让复杂的事情变简单，简单的事情更简单
7楼2013-10-09 09:32:16
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