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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » 综合其他 » Reviewer提的两个问题，求如何回答，如何做？万分感谢
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jghu9200

木虫 (小有名气)

[求助] Reviewer提的两个问题，求如何回答，如何做？万分感谢

Reviewer提的两个问题，本人对这个问题有点拿不准，求热心战友帮忙，如何回答？，如何做？万分感谢

Reviewer #2: The authors did address most concerns of the reviewer. However, there is one technical issue which has to be clarified.

1. In the MM section, the authors state that "To ensure that the samples were free of genomic DNA, RNA samples were subjected to a reverse transcription in the absence of the reverse transcriptase. Our results didn't find any genomic DNA contamination." The authors are correct to assume that if there is any contamination with genomic DNA, then there should be amplification in the subsequent PCR. HOWEVER, in case the primer is an exon-intron spanning oligonucleotide and the amplified intron is too long, than this genomic contamination band will not be visible in a 1% agarose gel. I strongly suggest performing another control experiment with contaminated RNA to ensure that the assay performed is sufficient to detect genomic DNA contamination.

3. Which strategy was followed to evaluate real-time PCR experiments?
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1楼 2013-09-26 21:09:12
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fuyuandj86

版主 (著名写手)

己所不欲，勿施于人

【答案】应助回帖

★ ★ ★ ★ ★ ★
感谢参与，应助指数 +1
gyesang: 金币+2, 正解！Reviewer的推理也是合理的，你至少说明你的引物是如何设计的，扩出基因组的条带会是多少大小，直接拿基因组DNA用你的引物扩增就可以了，做出一个有条带的结果 2013-09-27 15:34:59
jghu9200: 金币+4, ★★★很有帮助 2013-09-28 21:29:30
第一个说得很明白吧?让你补试验你就老实补吧.虽然似乎有点挑剔
我理解就是让你加个阳性对照,把RNA里面故意加入一点genomic DNA.然后用你的引物应该可以在胶上看到污染.
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The doer of good becomes good, the doer of evil becomes evil.
2楼2013-09-27 11:21:50
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niil

金虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★
感谢参与，应助指数 +1
gyesang: 金币+2, 鼓励回帖交流！ 2013-09-27 15:35:40
jghu9200: 金币+6, ★★★很有帮助 2013-09-28 21:29:16
1. 审稿者认为你的实验的对照有问题。你的对照是不加反转录酶，如果有条带的话，就是DNA污染，但是，由于DNA含有内含子，如果内含子长度过长而且你的引物是跨内含子设计的，那么你依旧不能扩出条带了，但是这种情况下依旧会有DNA污染，所以审稿人让你再设计其他的对照实验，以避免这样的问题。或者，如果你有证据证明你的引物不是跨内含子设计的，那么只向审稿人说明这个问题，并在方法里也相应加上说明就行了。
3.是问评估real-time PCR的方法。也就是你用什么方法来在证明你用这这个real-time PCR体系是有效的。一般来说，都是通过预实验绘制标准曲线来评估real-time PCR体系的优劣的。 每对引物在正式试验之前都需要做一个标准曲线，看获得的标准曲线的斜率是否符合标准。
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Stop fighting,let it flow.
3楼2013-09-27 14:00:30
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jghu9200

木虫 (小有名气)
引用回帖:
2楼: Originally posted by fuyuandj86 at 2013-09-27 11:21:50
第一个说得很明白吧?让你补试验你就老实补吧.虽然似乎有点挑剔
我理解就是让你加个阳性对照,把RNA里面故意加入一点genomic DNA.然后用你的引物应该可以在胶上看到污染.

谢谢
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4楼2013-09-28 21:27:50
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jghu9200

木虫 (小有名气)
引用回帖:
3楼: Originally posted by niil at 2013-09-27 14:00:30
1. 审稿者认为你的实验的对照有问题。你的对照是不加反转录酶，如果有条带的话，就是DNA污染，但是，由于DNA含有内含子，如果内含子长度过长而且你的引物是跨内含子设计的，那么你依旧不能扩出条带了，但是这种情况 ...

非常感谢
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5楼2013-09-28 21:28:38
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