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doubleping新虫 (小有名气)
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[求助]
虐心的PCR-DGGE
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实验做得我快绝望了！！！！ 我是做土壤微生物群落，先提取了土壤中的DNA，呈黄棕色，经过稀释不同倍数之后扩增出了16S，然后扩增了V3区，但是有非特异性条带，接着用V3产物去跑DGGE，62℃，20V，10min预跑，然后是62℃，7H，120V，一直在调试最好的梯度，刚调试到梯度47%-62%的时候，感觉条带还是有点靠下面，想再试试50%-60%。。。。。。可是悲剧就来了，竟然一条条带都没有跑出来，或者有时候有一块胶有条带有一块没有条带，（我用的是缓冲液7L的bio-rad的DGGE，可以同时跑两块胶）但是我点的DL2000都有跑出来，真让我郁闷！！！我以为是样品问题，但是同样的样品检测有亮带，还有一次竟然同样的样品第二次DGGE有条带还很多。 想重新扩增样品，可是这两天本来可以全部扩增出来的样品现在16S竟然有一半扩不出来，16S产物全部扩不出V3区，想不出什么道理！ 有16S可以扩出来，酶和16S引物应该是没有问题的，V3的引物是刚稀释的可能有问题，其他我就想不出来了，各位大侠帮我找找原因吧 我的体系，16S和V3区一样都是30ul， 2*taq mastermix 15ul 引物各 1ul 模板 1ul ddH2O 12ul 16S程序：94℃ 5min；94℃ 1min，55℃ 1min，72℃ 2min；30循环；72℃ 10min。 V3区程序：touchdown DGGE胶：47%-62% 47%：100%变性剂 9.4ml+0%变性剂 10.6ml+80ul APS+10ul TEMED 62%:100%变性剂 12.4ml+0%变性剂 7.6ml+80ul APS+10ul TEMED |
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15楼2013-11-21 20:51:28
2楼2013-09-22 07:57:45
3楼2013-09-22 08:54:20
doubleping
新虫 (小有名气)
- 应助: 0 (幼儿园)
- 金币: 6.3
- 散金: 10
- 帖子: 104
- 在线: 20.5小时
- 虫号: 1939351
- 注册: 2012-08-15
- 专业: 环境微生物学
4楼2013-09-22 09:42:02