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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » 综合其他 » SOE-PCR
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qsx04152006

木虫 (知名作家)

[求助] SOE-PCR

本人准备将两端基因连接在一起，一段长1620bp，，另一端长106bp，不知道用SOE-PCR能否将他们连接在一起。
1、107bp做pcr容易扩吗，产生引物二聚体的话怎么回收？
2、我的引物设计是否合适？重叠部分为20bp
基因1的序列：ATGGGGACAGTTAATAAACCTGTG.......CACTTCTACGATATGCCGCA
上游引物A：ATGGGGACAGTTAATAAACCTGTG（24bp）
下游引物B:  GAATAAATTGACAATATTTG+TGCGGCATATCGTAGAAGTG
基因2的序列,106+TAA：CAAATATTGTCAATTTATTCTACAGTGGCGAGCTCCCTAGCACTGGCAATCATGGTAGCTGGTCTATCCTTATGGATGTGCTCCAATGGGTCGTTACAATGCAGAA+TAA（共109bp）
上游引物C：CACTTCTACGATATGCCGCA（20bp，基因1的3”端20bp序列）+
CAAATATTGTCAATTTATTC（基因2的5“端20bp）
下游引物D：TTATTCTGCATTGTAACGACCCATTG（26bp），其中用引物A和B扩增基因1，用引物C和D扩增基因2，然后用各自的PCR产物做模板，不加引物空延伸7个循环，再用引物A和D为引物，以上步空延伸的产物做模板，进行PCR扩增，这样是否可行？请大家指点，谢谢！
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1楼 2013-09-04 11:11:42
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chjinzhi

银虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

★ ★ ★ ★ ★ ★ ★
感谢参与，应助指数 +1
gyesang: 金币+2, 鼓励回帖交流！ 2013-09-04 21:02:39
qsx04152006: 金币+5, ★有帮助, 能介绍一下touchdown-pcr吗？ 2013-09-05 11:48:02
1。107bp的片段还是容易扩增的。不是有胶回收嘛，怕啥引物二聚体呀！条带大小又不一样，实在不行，你提高琼脂糖浓度呗，那样分离更彻底一些。
2具体的还要看你用的酶，引物的退火温度等，设计程序还要注意延伸的时间。如果尝试了很多还是不行就利用touchdown-PCR试试吧。
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4楼2013-09-04 17:34:41
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qsx04152006

木虫 (知名作家)
另外，扩增出来的融合基因长度正好是两端基因的总长度吗，比如一段1620，一段109，融合基因正好是1629吗？谢谢。
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2楼2013-09-04 11:13:28
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chjinzhi

银虫 (正式写手)
★ ★
gyesang: 金币+2, 鼓励回帖交流！ 2013-09-04 21:02:31
引用回帖:
2楼: Originally posted by qsx04152006 at 2013-09-04 11:13:28
另外，扩增出来的融合基因长度正好是两端基因的总长度吗，比如一段1620，一段109，融合基因正好是1629吗？谢谢。

一般的，两个片段会有一定20-30bp的重叠区域。所以你要看自己设计的引物咯
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3楼2013-09-04 17:27:12
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qsx04152006

木虫 (知名作家)
引用回帖:
4楼: Originally posted by chjinzhi at 2013-09-04 17:34:41
1。107bp的片段还是容易扩增的。不是有胶回收嘛，怕啥引物二聚体呀！条带大小又不一样，实在不行，你提高琼脂糖浓度呗，那样分离更彻底一些。
2具体的还要看你用的酶，引物的退火温度等，设计程序还要注意延伸的时 ...

能介绍一下touchdown-pcr吗？
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5楼2013-09-05 11:48:09
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