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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 生物科学 » 细菌基因组DNA为什么提不出来？
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沧海蝴蝶

[交流] 细菌基因组DNA为什么提不出来？

提了两次红球菌的基因组DNA都没结果，请大家帮忙分析分析是什么原因。
具体步骤是：
      1、 50ml细菌过夜培养，取1.5ml  4000rpm离心10min 弃上清液，再浓缩一次
      2、加567ulTE  30ul ,10%sds,3ul 20mg/ml 蛋白酶K，混匀，于37度温浴1h
      3、加100ul 5mol/l Nacl ,加80ul CTAB/NACL，混匀，于65度温浴10min
      4、加等体积的氯仿/异戊醇，混匀，10000rpm  4度 离心5min 将上清液转移到新管中
      5、加等体积的酚/氯仿/异戊醇 混匀 10000rpm  4度 离心5min 将上清液转移到新管中
      6、加0.6体积的异丙醇，轻轻混合直到DNA沉淀下来，将沉淀转移至1ml 70%乙醇中洗涤
      7、离心5min ,弃上清液,干燥，重溶于100ul的TE缓冲液
每次做到第六步都没发现有DNA沉淀，不知道什么原因，很着急，麻烦高手指教。多谢！
[search]基因组DNA[/search]
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1楼 2007-11-14 23:00:44
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reasonspare

木虫 (著名写手)
★
johnsooh(金币+1,VIP+0):谢谢, 斑斑这么晚了还在工作???^_^
如果出现多糖等物质需要洗涤几次，推荐TES， 其他可以用生理盐水或者灭菌去离子水，
1 ok
应该
2 加入Te 后加入 lysome 37 度 1 h  或 更长时间，或者反复冻融（-20- 20度）超声波也可以考虑）总之先打破细胞壁。
加如 pro K 1h 去蛋白
3 加入 ＳＤＳ 后重复振荡，37 度 30min 或更长，
其他 不变，

[ Last edited by reasonspare on 2007-11-14 at 23:41 ]
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大慈大悲观世音救苦救难观世音有求必应观世音普渡众生观世音千手千眼观世音官大敢管观世音无处不在观世音普观普长观世音南无观世音菩萨
2楼2007-11-14 23:38:58
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hudong

金虫 (小有名气)
★
johnsooh(金币+1,VIP+0):谢谢提供经验方法
上面写的方法应该是没问题的，请你检查一下你用的所有试剂，试剂出问题的话也是没有 DNA。如果是一点DNA都没有的话，那很可能是试剂出问题了。建议重换试剂试试，或同时用其它方法试试。还有，你是小提，不用摇那么多的菌，用试管摇5ml就够了。
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3楼2007-11-15 08:18:00
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fengkai6200

银虫 (小有名气)
★
johnsooh(金币+1,VIP+0):谢谢提供经验方法
我是从肌肉组织提的dna。我加的SDS的量比你大，100ul10%SDS。在55度反应2小时。当然因为肌肉组织不好裂解，所以比提菌的DNA多加了SDS，提高了反应温度。
我觉得你可以适当的改变一下条件，加大点SDS的量，或延长反应的时间。
我这方法提取的DNA质量很好的，没有降解，做pcr的效果也很好的。
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4楼2007-11-15 09:45:29
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li3564617

金虫 (小有名气)
★
johnsooh(金币+1,VIP+0):谢谢提供经验方法
dna沉淀使用肉眼看不见的，你不妨提完后跑个电泳看看，上述方法应该没问题，我用上海生工的试剂盒用的方法根你的差不多，效果也不错
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5楼2007-11-15 11:55:46
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li3564617

金虫 (小有名气)
★
johnsooh(金币+1,VIP+0):谢谢提供经验方法
我们用无水乙醇沉淀，加入等体积的无水乙醇，-20摄氏度放置10分钟，然后4度离心
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6楼2007-11-15 11:59:21
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edragonfly

新虫 (初入文坛)
★
johnsooh(金币+1,VIP+0):谢谢提供经验方法
ctab和DNA在低浓度Na离子时会发生结合  具体浓度是多少不记得了  自己查一下 偶觉得这可能是个问题 建议加大一下Na离子浓度
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生活是一面镜子，所以微笑面对！
7楼2007-11-15 13:24:57
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edragonfly

新虫 (初入文坛)
★
johnsooh(金币+1,VIP+0):谢谢提供经验方法
第六部应该能看见DNA沉淀的 很明显的絮状沉淀 看不见可能就是没有提出来 这种提法 量应该还可以的 我以前提过链霉菌的  步骤也差不多
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生活是一面镜子，所以微笑面对！
8楼2007-11-15 13:28:04
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genehsy

金虫 (小有名气)
★
johnsooh(金币+1,VIP+0):谢谢提供经验方法
第六步中可以加1/10体积的3mol/L的醋酸钠促进DNA沉淀。
另外还有一种简单的方法你可以试一试，收集菌体用TE悬浮后直接用等体积的苯酚：氯仿（1：1）混合液直接抽提，离心取上清液，醇沉即可。
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9楼2007-11-15 19:35:24
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wbz66

★
johnsooh(金币+1,VIP+0):谢谢提供经验方法
DNA提取之后是看不见的,能看见的是一些蛋白质的杂质,建议跑个电泳看一下最好
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10楼2007-11-15 19:51:28
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